銀杏內酯A通過p38MAPK通路減輕中性粒細胞性哮喘小鼠氣道炎癥

王蓓蓓 徐芳 王愛利

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種慢性氣道炎癥性疾病，以氣道高反應、氣道粘液高分泌為特征，隨著病程的發展，可出現氣道重塑、肺組織結構性改變。盡管大部分哮喘對糖皮質激素治療敏感，仍有5%～10%重癥哮喘對糖皮質激素治療反應差，增加了非計劃門診、急診或住院率，嚴重者甚至會導致患者死亡[1]。中性粒細胞在重癥哮喘中發揮重要作用[2]，研究表明，在中性粒細胞為主的氣道炎癥中，伴隨氧化應激的病理過程[3]，且中性粒細胞與氧化應激關系密切。在McGovern等的研究中發現，氣道氧化應激產物與中性粒細胞在氣道的聚集與氣道高反應、氣道炎癥的形成有關，經抗氧化治療可阻止中性粒細胞趨化引誘物的合成及釋放，并減輕氣道炎癥及氣道高反應[4]。銀杏內酯A是一種從銀杏葉(Ginkgo biloba L)中分離而來的中藥成分，目前研究發現銀杏內酯A具有抗炎、抗氧化、減輕冠狀動脈內皮功能失調及神經元毒性保護作用[5-7]，基于銀杏內酯A的抗氧化、抗炎作用，我們通過中性粒細胞性哮喘模型探索GA對中性粒細胞為主的哮喘小鼠氣道炎癥的影響及作用機制，為重癥哮喘提供新的治療策略。

資料與方法

一、材料

BALB/c小鼠，雌性，6～8周，20～25 g，SPF級，購于湖北省實驗動物研究中心，動物合格證號：SYXK(鄂)2016-0057，小鼠于SPF級動物實驗環境中飼養，保證飲食充足，12小時光照、12小時黑暗循環，動物實驗獲本院倫理委員會審查批準。卵清蛋白(OVA)(grade V, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA)，銀杏內酯A、FCA(Sigma，USA)，DEX(天津金耀氨基酸有限公司)，SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗β-actin抗體(天津三箭生物技術有限公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(Aspen，USA)，兔抗磷酸化的ERK1/2抗體、兔抗磷酸化的p38抗體、兔抗磷酸化的p85抗體均購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司。

二、方法

1 哮喘模型建立及給藥干預

28只雌性BALB/c小鼠隨機分為對照組、哮喘組、GA干預組、DEX干預組。哮喘組、GA干預組及DEX干預組分別于第0、14、21天腹腔內注射20 ug卵清蛋白(OVA)+75 ul 氟氏制劑(CFA)致敏，從第22天開始直至第24天連續給予5% OVA霧化激發，每次激發30分鐘，一天一次，對照組給予PBS致敏及激發。GA干預組及DEX干預組每次激發前1小時給予80 mg/kg GA[8]或1 mg/kg DEX腹腔注射。

2 肺泡灌洗液細胞分析

末次激發后24小時，獲取各組小鼠肺泡灌洗液，參照先前的實驗方法[9]，即使用0.8 mL經4℃預冷的PBS進行雙側肺泡灌洗，共灌洗三次，每次灌洗后200 g，4℃條件下離心5分鐘。將三次細胞沉淀濃度調制1×106/mL，通過細胞計數板進行細胞總數計數，然后取200 μL細胞溶液進行迪夫快速(Diff-quick)染色，顯微鏡下取10個不同視野進行細胞分類計數。

3 肺泡灌洗中SOD的檢測

獲取第一次肺泡灌洗液(BALF)上清，使用SOD試劑盒檢測BALF中SOD水平，詳細操作步驟參照試劑盒說明書進行。

4 肺組織學檢測

末次激發24小時后，剪開胸壁，于右肺門處結扎右肺，通過2 ml注射器針頭(去掉尖端部分)將200 ul 10%中性多聚甲醛注入左肺，使其膨脹。于左肺門處結扎，獲取左肺，10%多聚甲醛固定24小時，石蠟包埋。沿左肺長軸切片，切片厚5 um，制片，脫蠟，蘇木精-伊紅(HE)染色、糖原(PAS)染色，光鏡下觀察氣道周圍炎癥及氣道內粘液分泌變化。

5 Western blot檢測

提取各組小鼠右肺組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度并進行相對定量，使各樣品總蛋白濃度一致。行SDS-PAGE，轉膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1h，洗滌，分別加1:1000稀釋的兔抗p-ERK1/2抗體、兔抗p-p38抗體、兔抗p-p85抗體、兔抗β-actin抗體4℃孵育過夜，洗滌，HRP標記的山羊抗兔二抗(1:4000)室溫孵育1h，TBST洗膜，ECL試劑盒化學發光法顯示蛋白條帶，圖像分析軟件測定蛋白條帶的吸光度值。

三、統計分析

所有資料通過GraphPad Prism 5進行統計繪圖。所得數值以`x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異有顯著性時進一步運用S-N-K法進行兩兩比較，P<0.05，表示平均值差異具有統計學意義。

結 果

一、GA減少中性粒細胞哮喘小鼠肺泡灌洗液中，中性粒細胞計數

末次激發后24小時進行肺泡灌洗液細胞總數及細胞分類計數，結果顯示哮喘組細胞總數、中性粒細胞計數及嗜酸性粒細胞計數均較對照組明顯升高，經GA干預后哮喘小鼠BALF中細胞總數、中性粒細胞計數均明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。而DEX干預組上述指標變化不明顯(P>0.05)(見表1)。

表1 GA減少中性粒細胞為主的哮喘小鼠BALF中白細胞總數及中性粒細胞計數(n=7,×104/L)

二、GA減輕中性粒細胞性哮喘小鼠氣道炎癥

為了探索GA對哮喘小鼠氣道周圍炎癥細胞聚集及粘液分泌的影響，我們對各實驗組小鼠肺組織進行H&E染色、PAS染色。哮喘組小鼠氣道及血管周圍可見明顯白細胞浸潤、膠原纖維沉積及粘液分泌，GA干預后哮喘小鼠氣道及血管周圍炎癥明顯減輕、杯狀細胞增生及粘液分泌明顯減少，而地塞米松干預組氣道及血管周圍炎癥變化不明顯(見圖1)。

圖1 各實驗組小鼠肺組織H&E染色、PAS染色哮喘組氣道周圍可見明顯炎性細胞浸潤，包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞的聚集增加(黑色粗箭頭)，粘液分泌增加(黑色細箭頭)，杯狀細胞增生(紅色細箭頭)，氣管壁明顯增厚；GA干預組氣道周圍炎癥細胞聚集明顯減少、黏液分泌細胞,杯狀細胞增生明顯減少，DEX干預組氣道及血管周圍炎癥上述變化不明顯。(×200)

三、GA降低了中性粒細胞性哮喘小鼠BALF中SOD水平

SOD是一種氧化應激產物，為了解GA對氣道氧化應激的影響，我們通過Elisa檢測了每組小鼠肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF)中SOD水平。結果表明，哮喘組BALF中SOD水平較對照組明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。經GA干預后，哮喘小鼠血清SOD水平明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。而DEX干預組SOD水平變化不明顯(見圖2)。

圖2 GA對哮喘小鼠BALF中SOD活性影響

四、GA對p38、ERK和p85活化的影響

結果顯示，哮喘組小鼠肺組織中p38被激活，其蛋白表達量較對照組明顯升高，經GA干預后p38/MAPK通路的活化明顯被抑制，差異有統計學意義，P<0.05。地塞米松干預組p38蛋白表達量無明顯變化，P>0.05。而p85和ERK的活化與對照組比較，差異無統計學意義，P>0.05(見圖3)。

討 論

支氣管哮喘是一個慢性氣道炎癥性疾病，目前全世界約有3億哮喘患者，每年約有25萬人因哮喘而過早地死亡。氧化應激在哮喘的病理過程中扮演重要的角色，因氧化應激過程中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平明顯增加[10]，從而導致氧化與抗氧化失衡，過多的ROS引起血管通透性增加，粘液高分泌，平滑肌收縮，氣道上皮脫落、損傷及氣道高反應[11-12]。SOD是一種對抗ROS的抗氧化物，在哮喘患者中SOD的活性明顯下降，且SOD活性下降與氣流受限程度及哮喘嚴重程度明顯相關[13-14]。與文獻報告一致，本實驗研究中也發現哮喘小鼠BALF中SOD水平較對照組明顯下降，提示哮喘小鼠炎癥部位SOD大量消耗，氧自由基清除能力下降。

圖3 GA對P38、ERK、P85活化的影響

銀杏內酯A是銀杏葉提取物中重要的活性物質，在多種疾病模型中顯示了良好的抗炎、抗氧化作用。郝艷玲等通過細胞水平缺血再灌注模型發現，銀杏內酯A可以增加SOD、減少乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平，降低心肌缺血再灌注的損傷程度[15]。Tosaki等研究表明聯合SOD和銀杏葉提取物(EGB761)可以明顯減少自由基的產生及再灌注導致的室顫(ventricular fibrillation,VF)和室速(ventricular tachycardia,VT)的發生[16]。本實驗研究也表明，在中性粒細胞性哮喘模型中，哮喘小鼠經銀杏內酯A干預后SOD水平明顯上升，并伴隨著氣道周圍炎癥的減輕，而地塞米松干預組SOD及氣道周圍炎癥變化均不明顯，提示了銀杏內酯A具有抗氧化作用，可能通過提高SOD水平，維持氧自由基生成與清除的動態平衡，從而對中性粒細胞性哮喘產生治療作用，為減少激素的抵抗提供了新的治療策略。

MAPK是高度保守的真核生物信號轉導酶，包括JNK、ERK、p38，受不同的細胞外刺激，如細胞因子、激素、應激等激活后，可將信號傳導至細胞核內部，調節細胞生長、分化、氧化應激和炎癥反應。其中ERK參與了哮喘氣道重構過程[17]，p38在介導糖皮質激素抵抗型哮喘病理過程中發揮重要作用[18]，p38MAPK活化程度與糖皮質激素治療的反應性及哮喘的臨床嚴重程度相關[19]。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)由一個催化亞基(p110)和一個調節亞基(p85)構成，參與氣道平滑肌增生及氣道重構過程。研究表明，p85在氣道上皮及氣道平滑肌中表達明顯增加，并與氣道平滑肌增生相關[20]。為了探索銀杏內酯A對中性粒細胞性哮喘的治療機制，我們檢測了各組肺組織中ERK、p38及p85活化后的蛋白表達情況，Western-blot結果分析顯示哮喘組p-p38含量較對照組明顯增加，而p-ERK及p-p85無明顯變化。經銀杏內酯A干預后肺組織中p-p38的表達明顯下降，提示了p38MAPK信號途徑參與了銀杏內酯A對中性粒細胞性哮喘的抗炎作用過程。

綜上所述，銀杏內酯A通過p38MAPK途徑調節中性粒細胞性哮喘氣道炎癥及氧化應激過程，對中性粒細胞性哮喘具有治療作用，為臨床重癥哮喘治療提供了新的依據，對減少激素的使用及其副作用具有重要意義。但銀杏內酯A調節p38MAPK的具體分子機制尚不明確，有待下一步體內及體外實驗進一步探討。