METTL14在非小細胞肺癌中的表達以及預后意義

徐朝久 趙景勝 龍劍 丁文信 吳紅花 梁靜

肺癌目前是我國發病率、死亡率最高的惡性腫瘤，并且由于工業化、環境污染等因素加重，肺癌的發病風險逐年攀升，肺癌，已經成為不容忽視的公共衛生問題[1]。而非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常見的組織類型，早期難以診斷，多數患者確診時已處于進展期，療效預后較差[2]。6-甲基腺嘌呤(m6A)是高等真核生物最關鍵的一種RNA修飾，經甲基轉移酶、組合蛋白及去甲基化酶調控后，能夠參與細胞凋亡、分化以及機體發育過程[3]。據報道甲基轉移酶METTL3在肺癌等多種癌癥中出現異常表達，并且促進癌細胞增殖，抑制細胞凋亡[4]。而METTL3與METTL14均能表現出甲基轉移酶活性，并且METTL14能表現出更高的酶活性[5]。目前鮮有關于METTL14與NSCLC之間聯系的臨床研究，因此我們本次研究將通過比較分析METTL14在NSCLC中的表達，探討METTL14對于NSCLC的臨床意義。

資料與方法

一、一般資料

選取2015年1月-2016年7月我院初診收治并行手術切除術的NSCLC患者64例，收集術中切除的癌變組織(研究組)及相應的癌旁正常組織(對照組)。患者年齡(29～75)歲，中位年齡為64.50歲，其中男44例，女20例。其他臨床資料(見表1)。納入標準：1)所有患者均符合NSCLC診斷標準[6]，且術前6個月內未行放、化療及相關治療；2)組織標本均經病理科確診，癌旁正常組織與病灶距離>5cm； 3)經超聲及支氣管鏡等影像學檢查，非處于妊娠期、哺乳期者或合并其他肺部疾病患者。排除標準：合并有其他系統惡性腫瘤及重要器官功能不全者。本次研究經我院醫學倫理委員會批準，所獲組織標本均經生理鹽水清洗后，迅速分裝儲存于-80℃液氮中。

表1 NSCLC患者的一般臨床資料[n(%)]

二、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測METTL14 mRNA表達

使用Trizol(美國INVITROGEN公司，15596018)提取組織中的總RNA，根據逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司，K1622)說明書將RNA逆轉錄為cDNA。采用PCR儀(美國BIO-RAD公司，iCycler iC)對目的序列進行擴增，TransStart Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司，AQ101-01)行qRT-PCR，引物序列均由上海吉瑪有限公司設計并合成(見表2)。反應體系：cDNA 2μL，正反向引物各0.4μL，2*TransStart Green qPCR SuperMix 10μL，使用Nuclease-free Water將反應體系補全至20μL。94℃預變性30s后采用兩步法進行反應： 94℃變性5s，60℃退火/延伸30s，共42個循環。設置3復孔，采用2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。

表2 引物序列

三、Western blot檢測METTL14蛋白表達

使用RIPA(上海碧云天生物有限公司，P0013B)裂解并提取組織中的蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物有限公司，P0010S)檢測蛋白濃度并配置蛋白樣品，經SDS-PAGE電泳后將甲醇活化的PVDF膜與凝膠夾一起放置于轉膜裝置中，100V常規穿膜90 min。然后將PVDF膜用5%脫脂奶粉，37℃封閉1 h，隨后分別加入METTL14、GAPDH抗體(美國abcam公司，ab220030、ab8245)稀釋，4℃下孵育過夜。次日使用PBS洗滌三次，每次10 min，隨后加入HRP標記的相應IgG二抗(美國abcam公司，ab205719)，37℃，孵育2 h，PBS洗滌三次，每次10 min，最后使用ECL發光試劑盒(上海碧云天生物有限公司，P0018)曝光顯影，使用QuantityOne軟件對掃描分析各條帶吸光度。以GAPDH為內參，計算蛋白相對表達水平。

四、統計學方法

使用SPSS 21.0進行統計學分析，GraphPad 8繪制所需圖片，計數數據以%表示,組間比較采用卡方檢驗。計量資料使用Mean±SD表示，組間比較使用配對t檢驗，采用Kaplan-Meier生存曲線繪制NSCLC患者生存情況，并采用Log-rank檢驗進行分析，采用多因素Cox回歸分析影響患者預后的獨立預后因素，當P<0.05為具有統計學差異。

結 果

一、METTL14 mRNA在NSCLC組織中的表達

qRT-PCR結果顯示，METTL14 mRNA在研究組與對照組中的相對表達量分別為(3.03±1.02)、(1.01±0.04)，METTL14 mRNA在NSCLC癌變組織中的表達較癌旁正常組織高，具有統計學差異(t=15.629,P<0.001)(見圖1)。

圖1 METTL14 mRNA在NSCLC組織中的表達

二、METTL14 蛋白在NSCLC組織中的表達

western blot檢測結果顯示，METTL14 蛋白在研究組與對照組中的相對表達量分別為(0.21±0.05)、(0.13±0.03)，NSCLC癌變組織中的METTL14 蛋白表達較癌旁正常組織中高，差異具有統計學意義(t=8.874,P<0.001)(見圖2)。

圖2 METTL14 蛋白在NSCLC組織中的表達

三、METTL14表達與NSCLC患者臨床病理特征之間的相關性

根據2.2中研究組METTL14蛋白表達的中位數0.21，將癌變組織分為METTL14高表達組、METTL14低表達組，每組32例，分析METTL14高、低表達與臨床病理特征之間的相關性，結果發現TNM Ⅲ+Ⅳ級、合并淋巴轉移的NSCLC患者METTL14高表達的比例較高，差異具有統計學意義(P<0.05)，METTL14高、低表達與患者的年齡、性別、病理類型以及吸煙史無關(P>0.05)(見表3)。

表3 METTL14表達與NSCLC患者臨床病理特征之間的相關性[n(%)]

四、METTL14表達與NSCLC患者生存及預后之間的關系

對64例患者進行電話隨訪，平均隨訪時間為27.5(7～36)個月，METTL14高、低表達的NSCLC患者中位生存時間分別為23.5、34.5個月，總生存率分別為15.63%、46.88%，METTL14低表達的NSCLC患者預后優于METTL14高表達患者(χ2=5.226，P<0.05)(見圖3)。隨后使用Cox多因素回歸模型分析NSCLC患者預后影響因素，結果發現METTL14高表達、TNM Ⅲ+Ⅳ級是影響NSCLC患者生存的獨立預后因素(P均<0.05)(見表4)。

表4 Cox多因素回歸模型分析NSCLC患者預后影響因素

圖3 METTL14高、低表達NSCLC患者的生存曲線

討 論

NSCLC(非小細胞肺癌)作為全球癌癥死亡的主要原因，與其他癌癥一樣，其發生發展過程過程亦是涉及多種基因和途徑改變的多階段過程[8]。而m6A修飾是一種通過影響mRNA剪切、穩定、翻譯等的RNA處理階段而調控細胞分化的轉錄組標記，其水平升高可能會改變細胞正常的分化途徑，導致細胞陷入祖細胞狀態，與肺癌、胰腺癌等實體瘤的獲得直接相關[9]。最近研究發現，m6A甲基化水平的降低，亦可以功能性抑制NSCLC細胞異常增殖和生長[10]，這為NSCLC的治療提供潛在的治療方向。

甲基轉移酶是一種多樣的大蛋白家族，其特點為一種存在S-腺苷甲硫氨酸特定結合結構域，目前已經被證明能夠促使哺乳動物RNA發生甲基化[11]，其中METTL3負責m6A形成[9]，METTL14是mRNA結合和穩定所必需的的組成部分[10]，METTL3、METTL14能與Wilms腫瘤相關蛋白共同組成m6A[12]。并且METTL3與METTL14結合后的復合體可以誘導m6A在mRNA上沉積[11]。有趣的是，METTL3與METTL14必須保持在一個復合體中才能保持活躍[13]。Wang[14]等學者通過對METTL 3-14復合體的生化結構進行研究后發現，Mettl14為METTL3在其活性中心附近提供了結構上的支持，使METTL 3催化成為可能, METTL 3-14復合體的穩定存在對在RNA底物中高效生產m6A具有至關重要的作用。因此METTL14通過激活METTL3，使得METTL3-14復合體具有更強的增強催化活性[5]。

本次研究通過采用qRT-PCR、western blot檢測METTL14在64對NSCLC癌變組織及癌旁正常組織中的表達，結果發現METTL14 mRNA與蛋白在NSCLC癌變組織中的表達較癌旁正常組織高，TNM Ⅲ+Ⅳ級、合并淋巴轉移的NSCLC患者METTL14高表達的比例較高，METTL14高、低表達與患者的年齡、性別、病理類型以及吸煙史無關，這與之前的研究呈現一致性[15-16]。

此外，我們還分析了METTL14高、低表達與NSCLC患者預后生存之間的聯系，結果發現METTL14低表達的NSCLC患者預后明顯優于METTL14高表達患者。Cox回歸模型分析發現METTL14高表達、TNM Ⅲ+Ⅳ級是影響NSCLC患者生存的獨立預后因素。說明METTL14高表達可能與NSCLC的預后不良相關，可能作為NSCLC預后篩查的一個分子靶標，而Martin[17]等學者研究發現較高水平的METTL14，會導致編碼m6A符合蛋白的基因改變，METTL14的缺失會誘導細胞生長抑制，細胞周期停止，誘導細胞凋亡和分化，這也從側面輔證了我們的觀點： METTL14高表達暗示不良預后。

綜上所述，METTL14在NSCLC中過表達，METTL14可能參與了NSCLC的發生發展過程，與患者預后息息相關，為NSCLC預后的評估提供了參考依據，這有助于我們對于m6A在NSCLC中的理解，可能成為NSCLC潛在的治療靶點。