NK 細胞的生物學及其腫瘤免疫治療研究進展

高紫玉，云升，邱英

(1.內蒙古醫科大學研究生學院，內蒙古 呼和浩特 010020；2.內蒙古醫科大學附屬醫院腫瘤內科，內蒙古 呼和浩特 010020)

0 引言

自1975 年在鼠類和人類中發現NK 細胞以來，有證據支持它們在病毒感染和腫瘤免疫監測的早期控制中發揮關鍵的作用。一項為期11 年的隨訪研究所示，在人類中，NK 細胞毒性降低與癌癥發病率增加相關[1]。NK 細胞對轉移性或血液系統腫瘤表現出快速而有效的免疫力，目前正致力于在臨床上充分利用NK 細胞的抗腫瘤特性。但實體腫瘤患者過繼輸注NK 細胞的結果卻差強人意，其主要挑戰之一是NK 細胞向腫瘤部位的運輸和浸潤。此外，腫瘤微環境中的抑制信號和腫瘤細胞免疫原性的改變也是腫瘤部位NK 細胞浸潤和活化不良的原因。本文對NK 細胞的生物學及其在腫瘤中的最新研究進展進行概述，以期為后續研究及臨床應用提供一些重要的參考依據。

1 NK 細胞的生物學

NK 細胞最初是在小鼠中鑒定的，研究人員注意到與T 和B 淋巴細胞截然不同的大顆粒亞型淋巴細胞，對小鼠腫瘤細胞系具有細胞毒活性[2]。從表型上看，NK 細胞表面缺乏B 和T細胞標記CD19 / TCR / CD3，但其表達CD16 和CD56 表面抗原。在外周循環中，大約90%的NK 細胞表達低水平的CD56，但具有高表達的CD16(CD16bright CD56dim)，這些細胞被認為是“成熟”的 NK 細胞，具有較高的細胞毒性。其余10%的NK 細胞為CD16dimCD56bright，被認為是“未成熟”的NK 細胞，通常存在于淋巴樣組織中，對刺激反應更強，并分泌多種細胞因子[3]。NK 細胞的活化是通過激活受體和抑制受體之間的平衡來介導的，激活的NK 細胞通過刺激腫瘤細胞上的Fas 受體與NK 細胞上的Fas 配體相互作用，促使NK 細胞釋放顆粒酶和穿孔素等進入腫瘤細胞，從而誘導caspase 級聯反應，最終在腫瘤細胞中發生凋亡[4]。在NK 細胞受體中，NK 細胞激活的主要檢查點是KIR 和NKG2A 抑制性受體，它們與自身HLA-I 類分子相互作用。目前已經在NK 細胞上發現了其他非HLA-I 類特異性抑制性受體，它們也影響了調節NK 細胞細胞毒性的最終平衡。這些受體包括T 細胞免疫球蛋白和ITIM 結構域(TIGIT)、PVR相關Ig 結構域(PVRIG)、淋巴細胞激活基因(LAG-3)、T 細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域包含-3(TIM-3)、程序性死亡-1(PD-1)和CD96[5]。這些非HLA-I 特異性的抑制性受體已成為NK 細胞活化的新免疫檢查點。NK 細胞表達的激活受體協調其觸發細胞毒性活性，包括NKG2D、NCRs(NKp46、NKp30 和NKp44)和DNAM-1，并被認為是NK 細胞與配體相互作用后對多種腫瘤進行活化的原因。

2 腫瘤微環境對NK 細胞的影響

癌癥最初被認為是一種細胞和基因表達失調的疾病，現在也被認為是腫瘤微環境(TME)的疾病。TME 是在腫瘤侵襲周圍組織的過程中產生的，它為腫瘤細胞、免疫細胞、基質細胞和細胞外基質提供了保護環境[6]。TME 會損害NK 細胞的表型，激活，持久性和功能。越來越多的數據表明，與非腫瘤組織中的NK 細胞相比，腫瘤組織中的NK 細胞顯示出較差的細胞毒性能力，并伴有激活受體的下調和抑制受體的上調[7]。多項研究顯示，多種實體瘤的生長會促進免疫抑制細胞(包括調節性T 細胞(Treg)，骨髓源性抑制細胞(MDSC)和腫瘤相關巨噬細胞(TAM))的擴增。另外，腫瘤細胞分泌趨化因子，如C-X-C 基序趨化因子配體8 或C-C 基序趨化因子配體2，以促進Tregs、MDSCs 或TAM 在腫瘤部位聚集。通過產生TGF-β 和IL-10，或通過細胞間直接的相互作用，這些免疫抑制細胞抑制瘤內NK 細胞的細胞毒作用[8-9]。MDSCs 通過膜結合型TGF-β 抑制NK 細胞的殺傷活性和細胞因子的分泌[10]。在腫瘤微環境的缺氧和炎癥條件下，MDSCs 會釋放高水平的腺苷。腺苷是一種重要的免疫抑制分子，通過限制IFN-γ/TNF-α 的釋放，抑制Fas配體和穿孔素介導的細胞毒活性，阻斷顆粒酶的胞吐而抑制NK 細胞的抗腫瘤活性[11]。腫瘤微環境中的腫瘤細胞，抗原呈遞細胞，免疫抑制細胞和基質細胞上表達PD-L1 或PD-L2，通過結合活化NK 細胞表達的抑制受體，導致NK 細胞衰竭和功能障礙[12]。深入了解TME 及其作用和相關分子將為認識不同類型腫瘤的生物學行為提供重要的見解，這些數據將為開發以TME 為基礎的治療方法以治療腫瘤提供必要的基礎，TME 中的原癌過程和分子將成為新的癌癥治療的重要靶點。

3 基于NK 細胞的腫瘤免疫治療策略

3.1 過繼免疫治療

NK 細胞過繼免疫療法的主要方法是未修飾的自體或異體NK 細胞的轉移。自體NK 細胞移植治療不同的血液系統惡性腫瘤和實體瘤是非常安全的，細胞的植入性和持久性較好，GvHD 的風險很低，但臨床益處有限[13]。在血液學癌癥患者自體造血干細胞移植(HSCT)后的早期觀察到與大量循環抗腫瘤NK 細胞相關的積極臨床結果[14]。相反，在轉移性黑色素瘤、腎細胞癌或晚期胃腸道癌中，經擴增的自體NK 細胞的轉移沒有顯示出積極的臨床反應[15-16]。在許多情況下，循環自體NK 細胞在沒有進一步的體外或體內刺激的情況下表現出弱的抗腫瘤細胞毒性。因此，近期進行的臨床試驗側重于免疫治療策略，即在化療、細胞毒性T 細胞或單克隆抗體(mAbs)的聯合環境下，用細胞因子(如IL-2/-15)或靶細胞(如K562-mb15-41BBL)激活自體NK 細胞，以達到其充分的抗腫瘤潛力。同種異體NK 細胞優于自體NK 細胞的原因在于，它不太可能被NK細胞介導的對自身MHC 分子的識別所抑制。從KIR 不匹配的供體過繼轉移單倍體NK 細胞已被證明是安全的，并且可以介導AML 患者完全緩解[17]。幾項臨床研究表明，異體輸注NK細胞在不同的癌癥環境(包括血液系統惡性腫瘤和實體瘤)中是安全有效的[18]。然而，目前關于NK 細胞過繼轉移在癌癥治療中有效證據仍然很少，許多都處于臨床實驗的第一期。在第1 期(NCT00402558)和第2 期(NCT01390402)臨床試驗中分析了異基因干細胞移植之前輸注單倍體NK 細胞的效果，該試驗招募了21 例高危AML，MDS 或CML 患者。HSCT 前的單倍性同種異體反應性NK 細胞輸注耐受性好，不會干擾植入或影響GvHD 的發生率，五名患者表現出持久的完全緩解[19]。然而實體瘤的NK 細胞免疫治療面臨著NK 細胞向腫瘤微環境的浸潤減少、腫瘤細胞對NK 細胞毒性缺乏敏感性、抑制性免疫細胞改變NK 細胞功能等挑戰。將以NK 細胞為基礎的免疫治療與可以靶向免疫抑制的腫瘤微環境的方法相結合，可能會在實體腫瘤的治療中提供好處。

3.2 CAR-NK 細胞

嵌合抗原受體(CAR)的T 細胞在血液學腫瘤中取得了巨大的成功，但在治療實體瘤方面不是很理想。CAR-T 細胞療法在臨床治療中也存在較多副作用，如細胞因子風暴、脫靶效應等。多項研究表明，CAR 修飾的NK 細胞可以克服CAR-T 細胞的上述缺點，并發揮顯著的抗腫瘤作用[20-21]。CAR-NK 細胞療法能靶向多種腫瘤抗原如神經節苷脂GD2、EGFR、CD244 受體、Wilms 腫瘤蛋白等，因此在治療實體瘤方面取得了良好的臨床效果。目前，臍帶血衍生的CAR-NK 細胞(CD19-CD28-zeta-2A-iCasp9-IL-15 轉導)正在針對復發/難治性CD19+B 淋巴惡性腫瘤進行臨床試驗(NCT03056339)。研究發現，在逆轉錄病毒轉導的幫助下，NKG2D-DAP10-CD3ζCAR-NK 細胞中的NKG2D 表達增加，進而導致針對白血病和實體瘤細胞的細胞毒性增強，而且未觀察到對健康細胞的細胞毒性增加[22]。在小鼠卵巢中衍生誘導的多能干細胞(iPSC)，通過CAR 修飾的NK 細胞增強了癌癥模型的抗腫瘤活性[23]。而且，這種iPSC 衍生的CAR-NK 療法已獲批準用于臨床，用于解決CAR-T 細胞存在的復發和高成本問題。

3.3 免疫檢查點

近年來，免疫檢查點抑制已成為免疫治療領域最有希望的治療之一。NK 細胞表達一系列抑制性受體，它們在浸潤腫瘤的NK 細胞上被誘導或上調，并且與各自的配體相互作用時影響NK 細胞的抗腫瘤功能，甚至導致NK 細胞功能障礙或衰竭[24]。用單克隆抗體(mAb)對免疫檢查點受體或配體的治療性阻斷可恢復NK 細胞的抗腫瘤功能。癌癥患者浸潤腫瘤的NK 細胞會誘導PD-1，從而導致活化的NK 細胞的功能衰竭，將導致預后不良。阻斷PD-1 / PD-L1 信號顯著增加了NK 細胞的細胞毒性和細胞因子產生，并顯著抑制了體內腫瘤的生長[25]。針對CTLA-4 和PD-1 檢查點途徑的單克隆抗體(mAb)的使用已獲批準用于臨床，可在各種類型的癌癥中產生持久的臨床反應[26]。此外，兩種途徑的聯合阻斷具有更好的治療益處，但可能產生的不良反應增多。

IPH2101、lirilumab(IPH2102)和 monalizumab(IPH2201)是針對KIR2DL1/2/3 和NKG2A 抑制受體的IgG4 單克隆抗體，并分別拮抗HLA-C 和HLA-E 介導的NK 細胞對腫瘤細胞的抑制作用[27-28]，IPH2101 阻斷HLA-KIR 相互作用可增強NK 細胞的抗腫瘤活性，從而提高生存率，顯示出對AML 細胞有效的臨床前證據[29]。IPH2101 聯合利妥昔單抗(抗CD20 單抗)可增加NK細胞介導的在體內外對小鼠淋巴瘤模型的殺傷作用[30]。在MM患者中輸注IPH2101 可降低NK 細胞表面KIR2D 受體的表達和NK 細胞的反應性[31]。NKG2A/CD94 在NK 細胞和CD8+T細胞上均有表達，在子宮頸癌，乳腺癌，肝細胞癌和肺癌等實體瘤中，上調HLA-E 的表達，抑制NKG2A 表達，改善NK 細胞功能障礙。在異基因和自體造血干細胞移植中，NKG2A 在新生成的NK 細胞上均勻表達，使NKG2A 和HLA-E 相互作用成為治療移植后NK 細胞功能的主要抑制因素之一[32-33]。IPH2201和西妥昔單抗(抗EGFR 單體)的聯合應用顯示，在以前治療過的頭頸部復發或轉移性鱗癌患者中，客觀緩解率為31%，沒有嚴重的不良反應[34]。IPH2201 目前正在多種腫瘤類型的I/II 期臨床試驗中進行評估，綜上所述，將抗KIR 或抗NKG2A 單克隆抗體與化學療法或靶向腫瘤抗原或免疫檢查點分子的其他單克隆抗體聯合使用可能是實現臨床療效的一種有前途的策略。

TIM-3 是T 細胞介導的免疫反應的負調節劑。與T 細胞相比，NK 細胞基本表達TIM-3，并且在人PBMC 中TIM-3 的表達最高。TIM-3 在所有成熟的CD16bright CD56dim 細胞上表達，在IL-12、IL-15 和/或IL-18 刺激下進一步上調。此外，細胞因子激活可誘導未成熟CD16dim CD56bright NK 細胞表達TIM-3，因此TIM-3 可作為成熟和/或活化NK 細胞的標志物[35]。TIM-3在進展期胃癌(88 例)、肺腺癌(89 例)和進展期黑色素瘤(90 例)患者外周血NK 細胞中表達上調，在75%的胃腸道間質瘤(GIST)患者的腫瘤浸潤性NK 細胞中也發現了這一點，有趣的是，GIST中TIM-3+腫瘤浸潤的NK 細胞不共表達PD-1[36]。Tim-3 阻滯劑是對PD-1 阻滯劑有抵抗力的患者的新興靶標，其中Tim-3的表達增加并被認為可以抑制腫瘤。這些研究表明，TIM-3 可作為預測癌癥預后的生物標志物，是恢復NK 細胞抗癌活性的潛在治療靶點。

4 小結

近十年中，癌癥免疫治療的成功發展代表了癌癥治療的一場革命。NK 細胞作為固有免疫中重要的效應細胞，具有強大的抗腫瘤功能。雖然NK 細胞在癌癥的研究和治療中還存在著很多挑戰，比如NK 細胞的激活途徑需進一步明確，某些藥物產生耐藥性以及機體自身易受損等，但從通過多種手段實現NK 細胞的過繼移植到基因修飾的NK 細胞，再到現有的檢查點抑制療法，這些不斷取得的成果讓我們有理由相信，NK 細胞在腫瘤免疫治療上的突破將不斷更新，同時也會為越來越多的癌癥患者帶去希望。