人卵巢組織冷凍及移植技術的研究進展及方向

章婷婷

（蘇州市立醫院東區，江蘇 蘇州）

0 引言

卵巢組織的冷凍保存及移植作為保存生育能力的手段已被研究多年。用于為育齡期婦女可能面臨的可能導致永久性不育的生育前卵巢急性損傷提供生育力保存。作為癌癥治療后最具毀滅性的后果,放療和化療可能導致患者生育力受損或完全喪失,尤其是盆腔放療和高劑量烷化劑如環磷酰胺,已被證明會導致卵巢萎縮,損害卵巢血管,并減少原始卵泡[1]。因此,在治療前保存生育力勢在必行。卵巢組織保存在育齡婦女人群中較為適用，而對于青春期的女孩，采取對卵巢進行冷凍的方法是體外保存生育力的唯一措施[2]。2004 年 Donnez 等[3]首次報道1 例IV 期霍奇金淋巴瘤患者,患者在進行化療前進行了卵巢皮質冷凍處理，6 年后將凍融的卵巢組織進行原位移植，妊娠后自然分娩一女嬰，嬰兒各指標均正常。這項報道證實了對于惡性腫瘤患者，采取卵巢冷凍技術能夠有效保存生育功能。之后有更多的研究證實了這一點[4]。同時將卵巢組織冷凍移植技術應用于推遲婦女更年期[5],亦可以提高女性患者的生活質量。

1 卵巢組織的獲取

組織收集是通過腹腔鏡手術進行的。卵巢組織提取的大小程度取決于卵巢功能衰竭的可能性。在臨床條件允許的情況下，最佳的手術治療方式為完整地將單側卵巢切除，而剩余一側的卵巢能夠正常地發揮該有的功能，也能為以后的卵巢原位移植提供條件。而對于保留的一側卵巢來說可能會受到后續治療的影響，導致其功能受損,甚至喪失生育能力。

另外,進行部分切除也是常用方法,去除一半或2/3的卵巢。用于切除卵巢微小組織(5×5×3mm)的技術并不常用,許多卵泡在凍融過程中由于缺血損傷而喪失[6],因此,必須獲得足夠大的組織以便儲存許多卵泡。獲得的卵巢組織在用PBS 洗滌后,將其放入含有IVF 培養基的無菌試管中,并運送至實驗室準備冷凍保存[7]。

2 冷凍保存技術

皮質主要由原始卵泡填充,由前顆粒細胞所包圍的初級卵母細胞。此外,研究發現在皮質中有很小的百分比卵泡已經開始發育,即初級卵泡。對于卵巢皮質采取直接冷凍的方法會有效地保存大量的原始卵泡，卵母細胞具有較小的體積，且結構較簡單，具有較低的代謝率，缺少透明帶，有較少的亞細胞器對低溫具有敏感性，在冷凍的過程中不容易受到損害，同時也不需要對卵巢進行刺激，或是等到卵子成熟，對患者的放化療不會產生影響。因為一種細胞類型的最佳冷凍保存技術可能對其他人無效[8]。卵巢皮質細胞之間的細胞大小、密度和膜水力滲透性的差異意味著冷凍保存所需的脫水速率以及理想的冷卻速率因細胞類型而異。卵巢組織冷凍保存的焦點是成功的凍結和解凍所有細胞亞型,促進最大數量原始卵泡的存活,因為它們直接代表生育力保存。

研究發現[9],大部分始基卵泡都聚集于距離皮質表面0.75mm 內的組織中,故一般認為,1mm 左右的卵巢組織皮質是最為合適的冷凍保存厚度，能夠最有效地保存始基卵泡，也可以通過面積的增加更好地滲透保護劑以達到理想的冷卻速度從而盡量減少對原始卵泡的損傷,獲得滿意的凍存效果。

3 卵巢組織的移植

3.1 卵巢移植的必要性和安全性評估

自體移植前,卵巢功能狀態的評估是必需的。卵巢衰竭表現為閉經,高促性腺激素、卵巢激素水平低,AMH 水平低以及超聲下觀察竇卵泡的減少也能提示卵巢衰竭。另外,有些病人在經歷了廣泛的原始卵泡儲存損失[10],在治療仍會偶爾出現不規則月經,這并不代表她的卵巢功能衰竭。雖然這些患者表現出顯著的激素紊亂,FSH 水平較高,但他們仍然可以在不需要卵巢組織移植的情況下受孕。

考慮病人的康復治療和復發風險,提高卵巢冷凍的安全性至關重要,盆腔超聲是必要的第一步,以確保沒有宏觀的卵巢病理存在,防止不必要的手術或并發癥。移植前,先將一小塊冰凍的皮質組織解凍,組織學染色,解凍后觀察是否有卵泡的存在,并確保沒有任何惡性細胞。常用的檢查手段有術前影像學檢查、術后的新鮮組織病理分析、冷凍后惡性細胞敏感標記物檢測等，聯合使用多種方法對于發現惡性腫瘤殘余細胞有重要作用，減少了細胞的種植，增加了其移植的安全系數。

文獻報道的15 例自體移植的霍奇金淋巴瘤病例中,無患者出現移植后的復發情況，而6 例非霍奇金淋巴瘤進行卵巢移植患者中無復發證據。Sanchez-Serrano 等分析在對乳腺癌患者進行卵巢冷凍保存后進行相關的組織學檢驗尚未發現有惡性腫瘤再植的情況。尤其對于早期的乳腺癌患者采取卵巢冷凍是一種安全的方法。

3.2 移植部位

3.2.1 原位移植

原位移植就是對于冷凍復蘇后的卵巢組織將其移植到盆腔中。原位移植可以出現更多卵泡,異位移植卵泡生長減少,卵母細胞恢復率和受精率降低。卵巢移植的一個關鍵考慮是維持移植組織的血液供應。缺血損傷是導致卵泡丟失的主要原因,因此,移植物充分灌注所需的時間在移植物存活中起著重要的作用。同位移植能夠有效地將自然的組織結構進行保存，同時也能保存一定的生殖功能，越是靠近輸卵管進行移植其自然受孕率越高。2015年[11]1 例28 歲葡萄牙女性接受冷凍10 年卵巢組織進行自體原位移植,術后通過卵巢刺激方案獲得2 個卵子,并成功獲得1 枚胚胎。

3.2.2 異位移植

異位移植指的是冷凍復蘇后的卵巢組織移植部位為非盆腔內，其常見的移植部位為腹壁及前壁的皮下。異位移植的優點是移植物便于觀察、移植或取出。尤其對于有盆腔粘連或是盆腔血供不具備較好的條件時采取異位移植效果較好。但是無血管移植,可能導致卵巢組織的缺血并加速殘存卵泡的閉鎖;且不能進行自然妊娠,必須進行促排卵、取卵和體外受精才能獲得妊娠。

4 完整卵巢移植

4.1 完整卵巢移植的優勢

該移植存在的問題主要是在新生血管生成期由于缺血的原因而導致丟失大量的卵泡,現已有研究嘗試使用額外的技術和環境因素作為一種手段,以改善移植血管重建,縮短缺血期,從而提高整體移植物存活率。有研究顯示SCID 小鼠卵巢移植顯示,當加入抗氧化劑、維生素E,卵泡存活率增加。但帶血管蒂的整體卵巢移植則可通過直接對血管進行吻合而減少組織的缺血損傷,從而有望保存更多的卵泡而使卵巢功能得以長久維持。Oktay 等[12]報告了59 例婦女通過卵巢片段移植術后,卵巢功能維持平均為(36.8±3.6)個月。卵巢功能維持時間最長者已超過7 年。

4.2 完整卵巢移植的的技術難點

整體卵巢移植存在的技術難點有:(1)整體卵巢冷凍困難。對于整體卵巢冷凍冷凍劑以及冷凍方式的選擇,仍沒有標準的冷凍方案。(2)冷凍前對整體卵巢的灌注不可避免地對卵巢組織和微血管帶來損傷,以及吻合術后血栓形成也會造成大量卵泡損失,導致其保存卵泡的優勢下降。(3)顯微外科血管吻合手術技術和手術時間也是影響卵巢移植后卵泡存活率的常見因素,對于外科操作的水平有更高的要求。(4)整體卵巢組織在攜帶了更多卵泡的同時,攜帶殘留癌細胞的風險加大。

最近關于卵巢組織冷凍和移植成功的懷孕和分娩的報告,為那些由于需要立即開始化療或放射治療而失去生育能力的患者提供了巨大的希望。需要更多的研究來優化冷凍保存和組織移植的流程。此外,進一步改進識別微小殘留病的方法是必要的,以確保沒有惡性細胞轉移及復發。整體卵巢移植為更好地保存生育力提供了方法,但同時也有更高的技術要求。能肯定的是,卵巢組織冷凍保存技術在生育力保存具有真實的潛力,為生育力保存提供了切實可行的新思路、新方向[13]。隨著科學技術的不斷進步,人卵巢冷凍技術將會得到進一步的提高，該技術會克服一些困難得到完善，在以后的應用中會充分發揮出應有的作用。