食品微生物快速檢測技術研究進展

郝海珍

（內蒙古烏蘭察布市疾病預防控制中心，內蒙古 烏蘭察布）

0 引言

當前，食品安全問題是一個重大的民生問題，受到了人們的廣泛關注，政府也將其提到了重要的議程上。而食品安全的風險監測與評估工作是食品檢測檢驗機構的重要任務。隨著科技的不斷發展及人們對于食品安全問題越來越重視，食品微生物成為食品安全評價指標的重要方面，一旦其受到污染將會導致食品安全出現問題。國家標準檢驗方法[1]對食品微生物常用的檢測技術為普通營養瓊脂平板及其他特定的培養基，通過肉眼觀察或是放大鏡進行有效的觀察，通過檢測觀察結果對食品的微生物是否受到污染及污染的程度進行判定。而檢測需要的步驟較為繁瑣，既費時間又費精力，一旦出現突發的食品安全問題后檢測結果一般都較為滯后。因此，應選擇一種更加安全有效的檢測方法，彌補常規檢測方法的不足。食品微生物快速檢測經過實證得出具有一定的可行性。該技術類型較多，且在食品微生物快速檢測發揮了重要的作用。本研究詳細分析了幾種檢測技術，進行了如下的綜述。

1 分子生物學技術

1.1 基因芯片技術

基因芯片技術采取預定位置進行固定的方法，載體上有核酸分子，數量為數千萬個，且呈現為微點陣列，對待測的樣品預先進行核酸片段的標記，在特定的條件下對樣品補片段及微點陣列核酸片段進行雜交處理，選用的雜交信號為特制的芯片閱讀儀[2]。陸長勇等用基因芯片技術對8種常見的食源性致病菌進行了有效的檢測，建立的基因芯片檢測方法基礎為單堿基延伸標簽反應原理，研究結果顯示對于食源性致病菌能夠進行快速靈敏的檢測，有效診斷了食源性疾病，在該類疾病中有很好的應用價值[3]。

1.2 核酸探針技術

核酸片段帶有標記物，且有已知序列，雜交時是與其帶有互補關系的核酸序列進行，在雜交的過程中形成雙鏈。該技術對于待測核酸樣品中的特定基因序列有一定的應用價值。微生物的種類不同使其具備了獨特的核酸片段，對這些片段進行有效的分離及標記處理，從而制備出探針。該技術在應用檢測中有較強的特異性及敏感性，能夠充分發揮出檢測優勢，但也有一定的不足之處存在，如常見的有探針應和菌相對應、需要對樣品進行一定時間的培養。該技術不適合檢測經毒素污染的不含產毒菌的食品[4]。

1.3 聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction，PCR) 檢測技術

PCR 檢測技術應用的范圍較廣，如食品中的大腸桿菌、金葡菌、乳酸桿菌等。該技術在應用中的優點是快速且具有一定的靈敏性，能夠有效地檢測出樣品中所含的細菌。但在應用期間也有一定的缺點，如只能鑒定核酸序列已知的細菌，對于細菌并不能判定死活，在定量上也能力較低[5]。

1.4 核酸恒溫擴增技術

PCR 技術反應過程中不斷的發生變化，這其中會引發溫度的改變影響到檢測。因此，這就需要在技術上保持恒定的溫度，也就是研究核酸恒溫擴增技術，試圖保證溫度不變的情況下增加DNA 或RNA 分子數目。該技術的應用會比PCR 更具有實用性。對于該技術有相關的研究人員針對副溶血性弧菌不耐熱溶血毒素基因的特點對特異性的引物進行了設計，同時對12 種細菌共28 株菌株進行環介導恒溫擴增，只有副溶血性弧菌呈陽性結果，因此提出了副溶血性弧菌的環介導恒溫擴增檢測方法[6]。

2 代謝學技術

2.1 三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生物發光技術

ATP 生物發光技術的原理是熒光素酶在Mg2+存在條件下，底物為ATP、D-熒光素、氧氣等，在能量上進行轉化，由化學能向光能轉化，同時釋放出一些光量子，其中發光的強度同樣品中的ATP 的關系為正比，提取出細菌ATP并對其含量進行測定，測定的方法為生物發光法，這樣能夠對樣品中的含菌量進行有效的推算。該技術在檢測中具有較短的周期，但檢測中靈敏度不高，得到的結果也不穩定。因此，為了改善該技術存在的不足之處，有研究者[7]對ATP 生物發光技術的反應條件進行了優化處理，并研制出了新的酶保護劑，優化后能夠對單個的細菌檢測出來，并在蘋果汁、熟肉制品及魚肉等食品的細菌總數上進行了檢測試用的。

2.2 電阻抗技術

培養基的電阻抗變化的確定方法為測定電導率，并繪出電導率時間曲線及微生物生長曲線，將二者之間的關系表現清楚，并以培養基電阻抗變化來對待測微生物生長繁殖特性進行判定。該方法的應用范圍也較廣，應用的優點包括具有較高的敏感度及較強的特異性，能夠進行快速的反應且有較好的重復性等。

2.3 微熱量計技術

微生物在生長繁殖期間會產生一定的熱量，可采用微熱量計對其測量，所得結果可通過計算機進行計算處理，同時繪制出熱曲線圖，所要體現的是產熱量對比時間，將該曲線圖與已知細菌的熱曲線圖進行了比較，對細菌之間的差異進行了鑒別。

2.4 放射測量法

放射測量法是一種聯合應用的新的檢測技術，是將物理的診斷方法與化學的診斷方法結合起來，通過細菌生長過程來測量分析培養基里鹽類底物、碳標記的碳水化合物等代謝產物一氧化碳，對培養前后一氧化碳的量進行對比，有效對微生物進行檢測。該方法具有較高的準確度，且具有較快的檢測速度，能夠進行自動化的檢測。

3 免疫學技術

3.1 免疫熒光技術（immunofluorescence technique,IFT）

該技術就是應用熒光標記技術，將抗體及抗原的特異性進行有效的結合，在對細菌觀察和鑒別中采用的是熒光顯微鏡。該技術能夠對沙門氏菌及葡萄球菌等進行快速的檢測。有人[8]利用間接熒光抗體檢測方法對中國對蝦弧菌病發病感染情況進行診斷，甚至還能對未發病感染的對蝦進行檢測。

3.2 免疫磁珠分離技術

免疫磁珠分離技術是利用一種能夠被磁力吸引且能結合抗體的磁珠，結合磁珠上的抗體及待檢樣品中的致病微生物特異性，形成一種復合體。由于磁珠上有致病微生物，在磁場的作用下會出現聚集的情況，將形成的復合物與其他的物質進行分離。國家標準《食品衛生微生物學檢驗》 已經把免疫磁珠捕獲法作為大腸桿菌的檢驗方法[9]。

3.3 酶聯熒光免疫分析技術 （enzyme linked fluorescence immunoassay，ELFIA）

ELFIA 屬于酶免疫分析技術，其底物為熒光劑，充分結合了酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和FIA 兩者的優點，在酶催化作用下底物發生了變化，成為了帶熒光的產物，分析熒光產物的量與樣品中被測物質的量，得出二者之間的關系是正相關。對待檢樣品通過熒光強度進行目的菌的定性或是定量的分析。

3.4 免疫層析技術

免疫層析技術在檢測中運用的是抗體-抗原之間相互吸附的作用，檢測操作更簡單，操作步驟簡便，不需要使用任何的儀器，對于現場檢測十分適合。

4 生物傳感器技術

該技術充分利用了生物敏感材料對于生物的敏感性，將敏感微生物的濃度進行有效的轉換，從而對食品中的微生物進行檢測。該技術的優點是具有較強的專一性及較高的準確度，操作起來方便快捷，能夠進行快速的分析，一般的檢測時間不超過20min，最快的在1min 內就能得到結果。

5 分析化學技術

5.1 氣相色譜法和高效液相色譜法

不同的微生物在化學組成及代謝產物上有所不同，因此，通過氣相色譜法及高效液相色譜技術直接分析液體中的細菌成分，對微生物的特異化學標志成分進行有效判定，從而利于微生物的診斷和檢測[10]。

5.2 微生物自動檢測法

微生物自動檢測法屬于一種理想的檢測技術，是將傳統的檢測技術與微生物檢測技術及計算機技術進行有效的結合，運用概率最大近似值模型對食品、環境等樣品中微生物進行自動檢測。該方法的檢測速度較快，在4-18h可以報告出具體的菌種。

6 小結

當前，食品安全風險監測及評估引起了極高的重視。因此，對于食品微生物檢測應建立快速有效的方法，以對食品安全問題進行有效的監測[10]。研究者應努力研究并不斷地完善現有技術，實現高速、有效、靈敏的檢驗[11,12]。