NIPT-plus用于產前檢測的現狀及發展前景

吳夢詩，羅欣

(重慶醫科大學附屬第一醫院 產科，重慶 400000)

0 引言

胎兒染色體異常(例如染色體非整倍性和染色體節段失衡)在妊娠中很常見，并且通常發生在植入前的胚胎期，由減數分裂分離錯誤或有絲分裂復制錯誤引起[1]。通常，它們會導致孕早期胚胎生長停滯，植入失敗或早期流產。但是，有1%-1.7%的胎兒仍具有發育能力，如果無法通過產前診斷發現，胎兒則可以持續生長發育到孕中期及孕晚期，它們會受到染色體異常的影響，并在出生時表現為染色體疾病綜合征。在1歲之前診斷出的主要先天性異常中，大約15%是由染色體異常引起的，其中25%將導致圍產期死亡[2]。對于存活的染色體異常的孩子，也很大可能伴隨智力低下，多發性發育不良或畸形。但是，到目前為止，對此尚無有效的治療措施。因此，在出生前檢測染色體疾病則尤為重要。許多國家為未出生的胎兒提供篩查計劃(產前檢測及診斷)，以識別某些有相關風險的孕婦，幫助其早期診斷和治療。隨著技術的進步同時也刺激了產前篩查計劃的發展，最初，常規的唐氏綜合征篩查僅在孕中期進行，僅使用甲胎蛋白(AFP)進行篩查，隨后擴大到包括全部或游離的β人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)，未結合的三聚雌三醇和二聚抑制素A。到90年代末，使用超聲影像學在孕期第三個月(例如頸部半透明層，鼻骨)和生化標志物，游離β-hCG和妊娠相關血漿蛋白A進行產前篩查也逐漸開展[3]。1997年，通過鑒定Y染色體特異性DNA片段，在孕婦血漿和血清樣品中首次發現了無細胞胎兒DNA(cffDNA)[4]。發展至今，cffDNA作為一種有前途的分子生物標志物，其發現使產前檢測發生了巨大轉變，也已被用于產科研究的各個方面，尤其在產前診斷和復雜妊娠中，可以更安全、更早地檢測到胎兒的遺傳狀況。胎兒染色體非整倍性的無創產前檢測(NIPT)為孕早期產前篩查提供了另一種高效的方法，并且自發現之日起便在世界范圍內迅速采用。隨著無創產前檢測(NIPT)的廣泛采用，許多通過傳統篩查方法歸為高危或低危妊娠的孕婦也開始選擇NIPT，這種選擇已經使侵入性診斷的需求降低高達40%[5]。目前商業領域已經擴大了cffDNA篩選的范圍，包括性染色體非整倍性，罕見的常染色體非整倍體和亞顯微拷貝數變異，且已經以“ NIPTplus”的形式開展檢測。

1 cffDNA介紹

在懷孕期間，可以在母體血漿中檢測到來自發育中的胎兒的DNA，并將其稱為無細胞胎兒DNA(cffDNA)，cffDNA起源于胎盤的滋養層，并由核酸內切酶降解后作為短dsDNA片段釋放到母體血中，長度為143bp，因此，cffDNA平均比母體無細胞DNA(cfDNA)短，后者的中位長度為166bp，它來源于身體多種組織細胞的自然裂解，其中大部分來自造血細胞。因此，孕婦血漿中的cfDNA是母體cfDNA和從胎盤釋放的無細胞胎兒DNA(cffDNA)的混合物，可用于測試胎兒的遺傳狀況[6]。通常在妊娠6至7周時可檢測到cffDNA，據報道最早的檢測是在4～5周時檢測到的[7]。cffDNA與總cfDNA的比例稱為胎兒分數，在整個懷孕期間都會增加，在妊娠晚期可能高達30%。胎兒分數隨母體BMI升高而降低，產婦年齡也與胎兒分數呈負相關[8]。胎兒出生并娩出胎盤后，cffDNA會在數小時內從母體循環中清除。自cffDNA發現以來，其徹底改變了產前基因檢測，從而允許開發用于非整倍體的非侵入性篩查方法，稱為非侵入性產前檢測(NIPT)或非侵入性產前篩查(NIPS)，以及針對單基因疾病的診斷檢測，稱為非侵入性產前診斷(NIPD)。染色體微陣列分析(CMA)，可檢測染色體的亞顯微拷貝數變化，被推薦為胎兒的一種或多種先天染色體異常檢測的一線測試[9]。而迅速發展的下一代測序(NGS)技術為產前診斷帶來了革命性的變化，使全基因組測序更快，更經濟。通過比較拷貝數變異，NGS已顯示出與CMA相當的準確性，NIPT是NGS技術的一個里程碑，當用于檢測母體血液中的無細胞胎兒DNA(cffDNA)時，為21三體性和其他非整倍性的胎兒診斷提供了卓越的準確性[10]。

2 無創產前檢測技術目前優點

多項研究已經證實了NIPT的檢出率及有效性，先前報道指出NIPT對21三體的敏感性為99.7%，而18三體性為97.9%，13三體性為99.0%[11]。NIPT對13三體和18三體的敏感性較低，是由于這些染色體的鳥嘌呤和胞嘧啶堿基的平均含量低于21號染色體，這在測序反應中引入了不均勻的偏倚。因此，NIPT相對于孕中期的生化篩查具有相當大的優勢，比孕前生化篩查和頸部半透明性測量有更高的特異性和敏感性。而且因為它的假陽性率較低，這也意味著在健康的妊娠中減少了許多不必要的侵入性檢查[12]。侵入性產前診斷的并發癥包括但不限于流產及感染等，在臨床實踐中，處于染色體異常高風險的孕婦由于擔心上述風險而經常拒絕進行侵入性產前診斷。因此，愿意接受NIPT的高風險孕婦人數也逐漸增加。從終止妊娠的時機上來說，NIPT可以從妊娠第9周開始進行，讓獲得陽性結果的婦女在數周內就是否終止妊娠能夠做出決定。相比之下，羊膜腔穿刺術從第15周開始進行，導致終止妊娠的程序更加復雜，也將給孕婦帶來更不利的心理和生理影響。加之侵入性產前診斷的開展需要較高的技術要求和實驗室平臺，因此該項技術的應用也受到局限[13]。NIPT的開發最初目的主要是檢測T21，T18和T13，這是產前篩查和診斷的重點。但是，技術的進步使胎兒其他疾病的檢測也成為可能，這對于預防先天缺陷是必不可少的。通過應用與染色體非整倍性分析相同的原理，NIPT也已擴展到檢測胎兒基因組內的染色體缺失和重復，即應用NIPT-Plus進行相關產前檢測。

3 無創產前檢測技術目前局限性

近年來，NIPT因其對T21，T18，T13和某些性染色體疾病具有很高的檢測率，已經改變了產前篩查和診斷。但是，盡管其具有高準確性，NIPT也有一些局限性。它對T21，T18和T13的檢測具有>90%的靈敏度和較低的假陽性率。對于常見的胎兒非整倍體和性染色體異常(SCA)，其假陽性率分別為0.09%和1%。假陽性病例最常見的是母親的染色體拷貝數變異(48%)，其次是局限性胎盤鑲嵌(32%)和母親患癌癥(15%)[14]。據文獻報道，估計約有2%-10%的具有頸部透明性異常的胎兒會被NIPT遺漏，以及一定比例的染色體結構重排，鑲嵌，三倍體和基因拷貝數變異。這很可能是由于胎兒cffDNA從母體血漿和MPS擴增而來，導致胎兒和母體DNA混合和部分降解。因此cfDNA測試不能代替早期超聲和血清標志物評估，因為這些技術可以識別其他高危胎兒狀況，例如無腦兒[15]。羊膜腔穿刺術最常用于中孕期快速核型分析，并被認為是在染色體異常高危妊娠中診斷胎兒染色體異常的金標準。據文獻報道，NIPT可能會錯過通過羊膜穿刺術和細胞遺傳學檢測所發現的染色體異常的30.0%。由于NIPT-plus的發展，該比例將來可能會降低。因此，不建議將NIPT作為具有超聲軟標記或病理超聲檢查結果的妊娠的染色體畸變的一線篩查方法，但NIPT可以被認為是對有腹腔穿刺禁忌證或擔心與手術相關的胎兒流產的妊娠的可接受的替代方法[16]。

4 NIPT-plus的發展前景

基于cfDNA分析的非侵入性產前檢查已改變了產前保健。以適當的費用進行NIPT是在一般妊娠人群中對常見胎兒三體性進行經濟高效高靈敏的一線篩查策略。與常規篩查相比，NIPT初級篩查提高了三體檢查的整體檢出率，并提供了更有效的介入式檢查參考，從而減少了進行侵入性產前檢查的次數與手術相關的流產和其他與手術相關的并發癥。NIPT能夠檢測T21/T18/T13和幾種性染色體疾病，但不能檢測結構異常，鑲嵌，微缺失或微重復。NIPT無法檢測到任何大小小于2Mb的染色體失衡，這可能反映了它對深度序列或讀取低濃度母體血液cff-DNA模板的局限性[17]。這些不可檢測的異常大多數不是致命性的，但從長遠來看，會通過增加不孕和流產的風險來影響生殖健康。最近，NIPT的進一步發展集中在對由節段染色體失衡引起的微缺失/微重復綜合征(MMS)的附加分析上。盡管MMS相對少見，但它們共同代表了很大的一組染色體疾病，占所有新生兒先天性異常的1%-2%，通常給家庭和社會造成沉重負擔。增強的NIPT方法(NIPT-Plus)對染色體微缺失/微重復，例如DiGeorge綜合征，(22q11.22微復制，每3000-6000個新生兒會出現一個此染色體異常新生兒)，鑲嵌性和不平衡易位等染色體異常則能夠進行檢測[18]。據研究，NIPT-Plus顯示出適用于檢測復發性MMS甚至潛在的全基因組MMS的一級篩選方法的標志。NIPT-Plus在檢測具有臨床意義的微缺失和微重復方面表現出很高的靈敏度和特異性，而在檢測常見的非整倍體方面也保持了很高的靈敏度和特異性[2]。在過去的幾年中，也曾有多次報道提示，通過NIPT發現了先前隱匿的母體惡性腫瘤(淋巴瘤，白血病，卵巢，結直腸，肛門，和神經內分泌癌和平滑肌肉瘤)。[19,20]無創產前檢測對于母體疾病早期診斷和治療是否會導致更好的生存率也需要更進一步的數據收集及研究。

5 總結

盡管NIPT已被臨床醫生和患者廣泛接受，以檢測常見的胎兒三體性和性染色體異常，但仍存在關于檢測罕見染色體疾病綜合征的附加臨床價值的爭論。2016年，美國醫學遺傳學與基因組學院更新了共識性指南，并建議無創性產前檢測(NIPT)可以代替傳統的血清學產前篩查[21]。在我國，越來越多的圍產期醫生也傾向于優先推薦使用NIPT進行產前檢測[22]。所有打算評估具有染色體異常胎兒可能性的孕婦都可以選擇產前檢查，而篩查階段為陽性或有其他危險因素的婦女則需要進行產前診斷：例如孕產婦高齡(35歲及以上)，遺傳病的家族病史或超聲檢查異常。在我國，通常建議35歲以上的孕婦直接接受侵入性產前診斷。但是，越來越多的專家認為，將年齡作為選擇產前診斷的唯一指標是不合適的。鑒于NIPT在產前檢查中的地位，因此應實施周到的指導方針，同時還要對從業人員和患者進行更好的教育。如果沒有指南，NIPT可能會導致不適當地的醫療實踐，損害患者的知情和自由選擇權。關于當前的NIPT指南，ACMG提倡將其用于常見的非整倍性染色體異常，且NIPT陽性結果也需要結合侵入性產前診斷[21]。NIPT-Plus在檢測三體異常，SCA和與DiGeorge綜合征相關的最常見的22q11.2微缺失方面表現出高性能，據此，對于染色體微缺失比染色體非整倍性更為頻繁的年輕女性，可以常規進行NIPT-Plus篩查。使用NIPT進行產前檢測正變得越來越普遍，而NIPT-Plus還將提供檢測染色體疾病綜合征的少見及罕見異常的可能性，這些染色體疾病綜合征在胎兒超聲檢查上沒有可見的異常，包括與智力障礙，發育遲緩，自閉癥以及大多數SCA相關的綜合征。因此，如果持續使用NIPT-Plus對所有孕婦進行一線篩查，則可能對降低患有這些綜合征的新生兒的發病率及產生的重大影響。最后，臨床醫生應熟悉所用測試的性能，并了解諸如產婦年齡和BMI之類的產婦狀況的影響，來綜合決定適宜的產前檢測方式。