微小RNA在肝臟缺血再灌注損傷中的研究進展

嚴啟航，陳睿，黃漢飛，曾仲

(昆明醫科大學第一附屬醫院器官移植中心，云南 昆明 650032)

0 引言

缺血再灌注損傷(ischemiareperfusioninjury，IRI)是指由于各種原因導致的組織和器官供血供氧減少，從而造成組織和器官損傷，但當供血供氧恢復后損傷反而進一步加重的病理生理過程。肝臟缺血再灌注損傷(hepaticischemiareperfusio ninjury，HIRI)多發生在休克、肝切除、肝移植等過程中，目前認為，IRI與肝移植后的早期移植物功能障礙密切相關[1]，輕度IRI可能導致17.4%的移植肝發生早期移植物功能障礙，經歷重度IRI的肝臟發生早期移植物功能障礙的比例可能高達88.9%[2]，IRI亦是肝移植術后膽道狹窄的主要原因[3]。對于如何減輕IRI以保護肝臟，成為目前器官移植領域亟需解決的問題。近年來，隨著對微小RNA(microRNA，miRNA)研究的不斷深入，發現其在HIRI過程中起著重要的調控作用，本文就以miRNA在HIRI中的研究作用進展作一綜述。

1 缺血再灌注損傷機制概述

1.1 缺血階段

在細胞水平上，缺血引發多種病理改變：一方面，由于血流供應的中斷導致細胞缺氧，從而破壞了線粒體氧化呼吸鏈的傳遞[4]；另一方面，缺氧致使線粒體低效率利用ATP進行無氧代謝，從而產生乳酸堆積、降低線粒體pH[5]。當ATP耗竭，Na+-K+泵無法通過主動轉運平衡細胞內外Na+、K+離子濃度時，大量Na+會通過Na+-H+通道從細胞外進入細胞內[6]；同時，內質網上的Ca2+泵失活，限制了胞內Ca2+攝入內質網。以上使得細胞內H+、Na+和Ca2+大量累積，細胞內滲透壓升高，胞內高滲透壓驅使水分子從胞外進入胞內，導致肝內肝細胞、Kupffer細胞、竇內皮細胞等腫脹[7]。

1.2 再灌注階段

在再灌注早期，由于電子傳輸鏈的破壞，大量電子泄漏導致活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量生成，并引誘導Kupffer細胞激活，產生更多的ROS，并且釋放TNF-α、IFN-β、IL-1、IL-12等促炎因子[8,9]。當大量的ROS聚集，體內超氧化物歧化酶不足及時將其降解，則會引起內皮細胞DNA損傷和氧化應激功能障礙，由此產生更多的羥自由基，破壞跨質膜離子梯度，造成細胞內外水電解質失衡，導致質膜破壞，胞內細胞器被釋放到周圍，引發細胞壞死和局部炎癥反應[10]。

2 miRNA功能概述

miRNA是一類由21-23個核苷酸組成的小分子單鏈RNA，不具備編碼蛋白的功能。在RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ的作用下于細胞核內轉錄相關miRNA基因得到初級miRNA(primarymicroRNA，pri-miRNA)，pri-miRNA是 長 度在數百到數千個堿基雙鏈RNA，具有5`帽結構和3`多聚腺苷酸尾，并形成一個到多個發夾莖環結構。當雙鏈RNA結合蛋白DGCR8識別pri-miRNA后形成Drosha-DGCR8微處理復合物，在核酸酶Drosha作用下水解pri-miRNA，將其剪切為大約70個核苷酸的前體miRNA(precursormicroRNA，pre-miRNA)。pre-miRNA通過轉運蛋白exportin5從胞核轉運至胞漿內，在胞漿中pre-miRNA末端的莖環結構被核酸內切酶Dicer水解切割，形成為21-23個堿基對的雙鏈RNA(doublestrandRNA，dsRNA)，dsRNA與Argonaute2蛋白結合形成RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，dsRNA在Argonaute2作 用 下 解 開 雙 鏈，將其中一條鏈從RISC釋放并迅速降解，剩余的一條鏈則保存在RISC中成為成熟miRNA[11,12]。當miRNA與信使RNA(messengerRNA，mRNA)的3`非編碼區(3` untranslated region，3`UTR)：①完全互補配對，RISC則可以降解mRNA；②不完全互補配對，RISC則抑制mRNA的翻譯，從以上兩種機制抑制靶基因mRNA的翻譯功能，從而達到基因表達調控的作用[13,14]，miRNA通過在轉錄后水平對mRNA的抑制功能，實現對細胞分化、凋亡、增殖、自噬等多方面的功能調控，以發揮其生物學功能[15]。

3 miRNA與凋亡

3.1 凋亡概述

凋亡是指機體在生理或病理條件下，為了維持自身內環境的穩態，發生的基因調控下單個細胞主動、有序的死亡，同時伴有細胞皺縮、核固縮、細胞膜重塑、凋亡小體形成等一系列細胞形態學改變[16]，以及半胱氨酸-天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)、Ca2+/Mg2+依賴的核酸內切酶以及需Ca2+蛋白酶活化等一系列生化改變，最后凋亡細胞被巨噬細胞吞噬而消亡，其發生途徑可分為內源性線粒體途徑和內質網途徑，以及外源性死亡受體途徑三條[17]。

3.2 miRNA通過線粒體途徑調控HIRI中的細胞凋亡

細胞凋亡的線粒體途徑主要是由于凋亡信號的傳導使線粒體膜通透性轉換孔道(mitochondrialpermeabilitytransiti onpore，MPTP)開放，從而改變線粒體膜的通透性，釋放細胞色素c(cytochrome c，Cytc)到細胞質內，激活caspase，形成凋亡小體并發生一系列的級聯反應，最終導致細胞發生程序性死亡[18,19]。

在缺氧、應激等細胞外信號的刺激下，可以激活磷脂酰肌 醇3-激 酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，Akt是PI3K重要的下游分子，由PI3K激活的Akt能促使Bcl-2與Bad分離，游離的Bcl-2通過阻止Cytc從線粒體釋放到胞質中，避免caspase的激活，發揮抗凋亡的生物學功能[20]。研究顯示，在HIRI模型中，miR-124能通過靶向抑制Rab38從而激活PI3K/Akt，上調Bcl-2，進而抑制caspase-3的活化，以抑制細胞發生凋亡[21]；miR-494通過磷酸酶與張力 蛋 白 同 源 物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)激活PI3K/Akt，抑制多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)和caspase-3，減 輕 肝 損 傷[22]；miR-21能通過PTEN激活PI3K/Akt信號通路，抑制糖原合成酶激 酶-3b(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK-3b)，減 少caspase-3和caspase-9的表達，從而抑制線粒體途徑細胞凋亡的啟動[23]；miR-142-3p通過MARCKS/PI3K/Akt信號途徑上調Bcl-2，下調caspase-3，減輕凋亡以保護HIRI后的肝功能；miR-494升高能激活PI3K/Akt，誘導下游低氧誘導因子-1a(hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1a)和 血 紅 素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)表達上調，caspase-3和caspase-7表達下調，減輕細胞在缺氧應激情況下的凋亡[24]；miR-27a-5p通過靶向Bach1增加HO-1的表達，上調Bcl-2發揮抗凋亡功能[25]。

Bax作為主要的促凋亡蛋白之一，在凋亡信號的刺激下，Bax可轉位至線粒體膜并形成聚合物，開放MPTP并釋放Cytc，在dATP存在條件下，Cytc與凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)結合，招募caspase-9在其上形成寡聚物，進而激活caspase-3，啟動級聯反應，促使細胞凋亡[26]。研究顯示，通過干擾鋅指E-盒結合同源異型盒蛋白1(zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1)能上調Bax的表達[27]，Wu，Y等[28]證實miR-200c可以靶向干擾ZEB1的表達，并在H2O2誘導的細胞模型以及動物HIRI模型中通過抑制和過表達miR-200c，揭示了miR-200c能通過抑制ZEB1上調PARP和caspase-3的表達，誘導細胞凋亡發生。另一項研究中，Xiao，Y等[29]通過miR-219a-5p抑制腫瘤蛋白p53結合蛋白2(tumorproteinp53 bindingprotein 2，TP53BP2)，抑制TP53轉錄活性，下調Bax和p21表達，減輕凋亡，從而減輕HIRI中肝細胞損傷。

轉錄因子Nfib的抗凋亡作用在多種腫瘤中均有報道[30-32]，Roy，S等[33]通過小鼠HIRI模型和細胞氧化應激模型，并結合急性肝衰竭患者的資料，充分證實了miR-1224在IRI過程能夠靶向Nfib從而抑制其抗凋亡功能，增加肝損傷，同時還發現miR-1224特異性來自肝細胞，血清含量變化與ALT、AST變化水平一致，可以作為反映肝細胞損傷的生物標志物。

凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)可以和釋放的Cytc結合發生寡聚化，并與caspase-9結合形成凋亡小體，介導細胞發生凋亡。miR-183可以通過靶向Apaf-1從而抑制下游caspase-9和caspase-3的活化，下調ALT、AST活性，發揮護肝功能[34]。

3.3 miRNA通過內質網途徑調控HIRI中的細胞凋亡

內質網是細胞內蛋白質合成、加工、修飾并折疊成熟的主要場所，內質網作為細胞內重要的Ca2+儲存細胞器，在維持細胞Ca2+離子穩定方面起到重要的作用。如果內質網腔內Ca2+離子發生失衡、錯誤折疊或未折疊蛋白增多，均會引起內質網應激(endoplasmicreticulumstress，ERS)，過度的ERS會觸發細胞內的凋亡信號，促使細胞凋亡。ERS主要由肌醇需求酶1(inositolrequiringenzyme 1，IRE1)、蛋白激酶R樣內質網激酶(PRKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和活化轉錄因子6(activatingtranscriptionfactor 6，ATF6)介導[35]。當發生ERS時，非折疊蛋白或錯誤折疊蛋白與IRE1、PERK、ATF6競爭性結合葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein78kD，GRP78)，使IRE1、PERK、ATF6解離從而激活下游信號通路。過度的ERS可以激活CCAT增強子結合蛋白同源蛋白(CCATenhancerbindingproteinhomologousprotein，CHOP)和caspase-12，從而誘導細胞凋亡的發生[36]。

研究報道過氧化物酶體增殖劑激活受體g(peroxisome proliferatoractivated receptorgamma，PPARg)可 以 作 為HIRI的一個治療靶點[37,38]，而miR-27a能夠靶向抑制PPARg[39]，進一步研究發現，在大鼠HIRI模型中通過抑制miR-27a能下調GRP78和CHOP的表達，降低血清ALT、AST含量，TUNEL檢測顯示肝組織凋亡細胞減少，而進一步沉默PPARg，使GRP78和CHOP表達上調，發生ERS，加重細胞凋亡與壞死程度，說明miR-27a對大鼠HIRI的保護作用通過是PPARg調控內質網途徑的細胞凋亡實現[40]。另一項研究中，用小鼠建立HIRI模型和用巨噬細胞細胞系建立細胞低氧/復氧(hypoxia reoxygenation，H/R)模型，過表達miR-199a-5p后ERS相關GRP78、ATF6、IRE1和CHOP在mRNA水平和蛋白水平表達量均發生下調[41]。

3.4 miRNA通過死亡受體途徑調控HIRI中的細胞凋亡

死亡受體是錨定在細胞膜上的跨膜蛋白，其胞外部分的結構富含半胱氨酸，胞內部分則含有具有蛋白水解功能的死亡結構域[42]。當死亡受體的胞外部分接受到凋亡刺激信號后，將信號傳遞至胞內，由死亡受體招募TRADD、TRAF1/2、cIAP1/2、RIP1等銜接蛋白，激活caspase-8，并進一步激活caspase-3、caspase-7啟動凋亡[43]。

高遷移率族蛋白1(highmobilitygroupbox 1，HMGB1)是晚期炎癥的標志物，可以促使核因子活化B細胞k輕鏈增強子(nuclear factor-kappa B，NF-kB)活化，釋放TNF-a，通過與TNF受體結合向胞內傳遞死亡信號，啟動細胞凋亡。在大鼠HIRI模型中，miR-449b-5p通過靶向HMGB1抑制其表達，進而通過減少NF-kB的激活，降低caspase-3、caspase-9的表達，減輕肝損傷[44]。而miR-9-5p能直接通過靶向NF-kB抑制凋亡[45]，miR-214則能抑制傳遞信號到胞內的重要蛋白TRAF1，通過負調節TRAF1/ASK1/JNK通路抑制HIRI后的肝細胞凋亡[46]。

4 miRNA與自噬

4.1 自噬概述

自噬是以胞質內出現雙層膜結構包裹長壽命蛋白和細胞器的自噬小體為特征的細胞程序性死亡。正常情況下，哺乳動物雷帕霉素靶標(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)處于活化狀態，通過磷酸化ULK1蛋白激酶復合體而抑制自噬的發生，在饑餓、氧化應激、蛋白折疊錯誤等情況下，mTOR失活使ULK1發生去磷酸化，誘導自噬啟動[47,48]。激活的ULK1使Beclin1發生磷酸化，并與Vps34和Vps15結合形成Vps34-Vps15-Beclin1復合物，招募Atg12-Atg5-Atg16L復合物定位至自噬泡外膜。同時，在誘導自噬以后，胞漿可溶形式的自噬微管相關蛋白輕鏈3-I(microtubule-associatedprotein 1 lightchain 3-I，LC3-I)在Atg7、Atg3以 及Atg12-Atg5-Atg16L復合物的作用下與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺相耦聯形成LC3-Ⅱ，并錨定在自噬體膜上，其含量隨自噬體膜的增多而增加，是自噬體的重要分子標志[49]。LC3-Ⅱ通過與結合了泛素化寡蛋白的p62相結合，從而將泛素化寡蛋白包裹進自噬泡，自噬泡進一步與溶酶體融合成為自噬溶酶體，降解自噬底物[50]。

4.2 miRNA在HIRI中對自噬的調控

研究報道，在小鼠HIRI模型中過表達miR-30b-5p能有效改善IRI后的肝損傷，進一步研究發現miR-30b-5p可以通過結合Atg12 mRNA的3`UTR抑制其翻譯，通過建立H/R細胞模型進行機制研究，發現過表達miR-30b-5p后Atg12-Atg5和LC3-Ⅱ表達降低，細胞活力增加，而抑制miR-30b-5p后Atg12-Atg5和LC3-Ⅱ表達則升高，細胞活力下降，證明miR-30b-5p在HIRI中能抑制自噬保護肝細胞[51]。另一項研究揭示了發生HIRI后，miR-17可以通過靶向Stat3上調Beclin1和LC3B-Ⅱ，下調p62，通過激活自噬加重肝細胞損傷[52]。Sun，X. L等[53]建立HIRI模型小鼠，并在2h、6h、12h、24h取材進行檢測分析，發現在肝組織損傷最嚴重的12h時間點上，LC3-Ⅱ和PGAM5上調最明顯，而p62和miR-330-3p下調最明顯，進一步在小鼠模型上過表達miR-330-3p，能明顯減輕IRI后的肝損傷，通過在H/R細胞模型上進行機制探索，揭示了miR-330-3p能夠靶向PGAM5，通過抑制線粒體自噬減輕IRI后的肝損傷。Song，H等[54]人的研究發現，HIRI過程中，miR-101可以通過激活mTOR抑制自噬發生，減輕細胞損傷。Zhang，L等[55]則揭示了miR-20a通過抑制Beclin-1在自噬體膜成膜延伸階段抑制自噬，減輕HIRI后的肝損傷。

5 miRNA與ceRNA機制

5.1 ceRNA機制概述

競爭性內源RNA(competingendogenousRNA，ceRNA)可以通過競爭性結合miRNA來更精細的調節基因表達。當內源性長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)、環狀RNA(circularRNA，circRNA)等RNA存在相關的miRNA應答元件(microRNAresponseelement，MRE)，就可以與相應miRNA發生競爭性結合，從而間接調控 miRNA對靶mRNA的負性調控作用，這種競爭性結合miRNA又被稱為miRNA海綿作用[56,57]。

5.2 lncRNA在HIRI中對miRNA的調控

lncRNA通常定義為長度在200個核苷酸以上，且不編碼蛋白質的轉錄本，能通過參與轉錄激活、轉錄抑制、染色質重塑、RNA剪切等過程發揮相應的生物學功能[58]。通過RNA下拉實驗，Huang，X等[59]證實了lncRNAMEG3與miR-34a存在相互作用，并通過過表達、敲低以及功能回復實驗，在動物模型和細胞模型上均證明了HIRI過程中，lncRNAMEG3通過負性調控miR-34a，從而上調其靶基因Nrf2的表達，增加細胞凋亡，并增加了ALT、AST活性。Dai，B等[41]發現lncRNAAK054386通過海綿吸附miR-199，在HIRI過程中上調了GRP78、ATF6、IRE1a和CHOP的表達，從而發生ERS，加重肝細胞損傷。lncRNAHOTAIR通過吸附miR-20b-5p上調Atg7的表達，增加細胞自噬[60]。lncRNAGm4419在HIRI中通過miR-455上調SOX6，從而促進Bax并抑制Bcl-2的表達，促進細胞凋亡，增加肝損傷[61]。

5.3 circRNA在HIRI中對miRNA的調控

circRNA是具有閉合環狀結構的非編碼RNA，主要由mRNA前體的外顯子經反向剪接環化而成，其在體內表達穩定，不易降解，能通過內源性競爭結合miRNA、調控可變剪切、調控親本基因表達等途徑發揮其生物學功能[62,63]。Zhang P等[64]通過小鼠HIRI模型，用微陣列雜交找到差異表達的circRNA，聯合GO、KEGG富集分析，并進一步用qRTPCR擴增驗證，篩選出6個circRNA，構建circRNA-miRNAmRNA互作網絡圖，最終預測篩選出mmu_circRNA_005186-miR-124-3p-Epha2調控軸進行實驗驗證。用雙熒光素酶報告基因檢測和qRT-PCR證明mmu_circRNA_005186通過海綿作用miR-124-3p增強了Epha2的表達水平，用針對mmu_circRNA_005186的siRNA轉染RAW 264.7細胞系48h再用LSP刺激，檢測到TNF-α和IL-1β明顯低于對照組，而miR-124-3p上調6倍，Epha2表達水平明顯下降。該研究揭示了mmu_circRNA_005186可以通過海綿吸附miR-124-3p，從而間接促進Epha2的功能，減輕HIRI后的細胞損傷。

6 總結與展望

目前在HIRI研究領域，有更多的人將目光投向了miRNA，這些研究進一步揭示了miRNA在HIRI過程中參與的精密調控作用。除此之外，miRNA還有作為生物標志物極大的潛力，比如在HIRI發生過程中，有miR-122[65-70]、miR-1224[33]、miR-370[71-73]、miR-155[74-76]、miR-21[23,69,77]、miR-223[69,78]、miR-450b-5p等[79]上調，而miR-146a[80]、miR-182-3p[81]、miR-24-3p等[82]下調，其中miR-122和miR-1224，其表達量不僅與肝細胞損傷程度一致，而且還是在肝臟特異表達的miRNA，有極大的作為HIRI分子標志物的潛力。而在通過miRNA減輕HIRI的藥物治療方面，七氟烷可以通過上調miR-9-5p，抑制NF-kB通路而抑制細胞凋亡[45]，可以通過下調miR-200c抑制細胞凋亡[28]；異丙酚通過上調miR-33a-5p，抑制MAPK6的表達發揮抗凋亡作用[83]。生物治療方面，也有關于使用間充質干細胞通過miR-370[73]、miR-20a[55]、miR-19a[84]改善HIRI。目前miRNA對HIRI機制調控的研究還處于細胞實驗和動物實驗階段，對于在臨床上如何以miRNA為靶點改善HIRI，其有效性和安全性又如何，有待進一步深入研究，不過這也為我們如何減輕HIRI以及能否利用miRNA評估肝損傷提供了一個思路。