芪丹益肺通竅顆粒對變應性鼻炎大鼠血清IL-4、IFN-γ的影響

劉慧霞 劉莉 李東棋 吳躍 田理

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是I型變態反應介導的鼻腔黏膜高反應性疾病[1]。據報道[2-3]，AR發病率影響全世界高達40%的人口，而該病在中國的發病率也高于35%，是全球范圍內患病率增長迅速的呼吸道疾病。同時AR具有高復發率的特點，易出現鼻竇炎、支氣管哮喘等并發癥，嚴重影響患者的生活質量[4]。益氣活血法是臨床治療AR有效方法之一，祖國醫學在益氣扶正方面已有文獻記載，《素問》言“邪之所湊，其氣必虛”、“正氣存內，邪不可干”，純中藥芪丹益肺通竅顆粒是田理教授基于“肺心同治”和經方時用來治療AR的有效內治法，前期研究表明對本病癥狀緩解及預防復發有顯著優勢[5-6]，本實驗通過研究芪丹益肺通竅顆粒治療變應性鼻炎大鼠行為學觀察、臟器系數及血清白介素4(Interleukin 4，IL-4)、γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)表達的影響，探討芪丹益肺通竅顆粒在AR 大鼠中的免疫調節機制，并為該方劑的臨床應用提供可靠的實驗依據。

1 材料

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠32只，雌雄各半，體質量180～220g(購買于成都達碩有限公司，生產許可證號：SCXK(川)2020-030)，由SPF大小鼠維持飼料喂養(北京科澳協力飼料有限公司生產，生產許可證號：SCXK(京)2019-0003)；飲水：實驗動物飲用水(純化水)，自制。以上動物飼養于四川省食品藥品檢驗檢測院(實驗單位實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2020-127)。飼養條件：飲水自由不受限制；籠舍：4只每籠飼養，雌雄分開；環境：SPF級大鼠飼養于屏障系統內，飼養房間采用12/12小時明暗交替照明，保持溫度20℃～26℃，相對濕度40%～70%。

1.2藥物與試劑

1.2.1藥物芪丹益肺通竅顆粒，中藥處方包括黃芪、白術、防風、牡丹皮、川穹、黃芩、生荊芥等11味藥，均由成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供，并由其制備而成。以上諸藥均由藥劑科袁華強藥師鑒定，符合國家中藥的臨床應用標準。取芪丹益肺通竅顆粒生藥141g，加純凈水煎煮至濃度為2.8g/mL，于冰箱中冷藏保存備用。氯雷他定片(10 mg/片，海南海神同洲制藥有限公司，批號:H20040797)。

1.2.2試劑 卵清白蛋白(大連美倫生物技術有限公司 批號:M0228)；氫氧化鋁粉末(哈藥集團生物制藥有限公司生產)；IL-4 ELISA 檢測試劑盒(ExCell Bio批號:22J009)；IFN-γELISA 檢測試劑盒(ExCell Bio批號:BZZ1185)。

1.3儀器 電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司儀器SQPQVINTIX2102-ICN)；高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司ST16R型)；金屬浴(Scilogex 型號：HB120-S)；低溫離心機(恒諾 型號：Ministar)；酶標儀(普朗 型號：DNM9602G)；移液槍(艾斯瑪特 型號：5-50μL；20-200μL；200-1000μL)。

2 方法

2.1動物造模、分組及給藥 將32只SPF級SD大鼠適應性喂養3天后，雌雄各半，分別稱重、標記，根據隨機數字表隨機分為空白對照組、AR模型組和治療組，治療組又分為AR+芪丹益肺通竅顆粒組與AR+氯雷他定組，各組8只。造模方法參照AR 動物模型制備規范(草案)[7]。初步致敏：除空白組外，其余3組將0.3mg的卵清蛋白與30mg的氫氧化鋁粉末和1mL的生理鹽水相混合，制成混合懸液腹腔注射，隔日一次，共7次。強化致敏：然后使用OVA滴鼻行局部激發，均以5%卵清蛋白局部鼻腔免疫，每只每側50μL，1次/日。對大鼠進行最后一次鼻腔制造過敏反應30min以內，參照表1持續觀察大鼠出現的癥狀，上述指標可疊加定量評分，分數大于5分則成功造模[8]。造模成功后，空白對照組不做處理，按照《藥理實驗方法學》各組藥物灌胃劑量如下：中藥組灌胃芪丹益肺通竅顆粒溶液(10mL/kg)，2次/日，氯雷他定AR組每日以成人臨床劑量8倍的氯雷他定(0.9mg/kg)灌胃，1次/日[9-10]，模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，2次/日，連續給藥14天。每次用藥治療后采用5%卵清蛋白局部鼻腔免疫每只100μL，1次/日，共14次，空白組以等量PBS緩沖液滴鼻，30min 內觀察動物的行為。

表1 行為學評分標準

2.2癥狀學觀察 觀察大鼠撓鼻次數、打噴嚏次數等并記錄評分。

2.3樣本采集 于第14次治療24小時后，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠后處死，取腹主動脈血保存備用。

2.4ELISA檢測血清 IL-4及IFN-γ的含量 采用ELISA試劑盒檢測血清中的 IL-4、IFN-γ等細胞因子濃度，單位用Ku/L 表示。

3 結果

3.1芪丹益肺通竅顆粒對AR大鼠鼻部癥狀觀察(見表2)。

與空白對照組比較，激發第1天、7天模型對照組大鼠鼻部癥狀評分升高(P<0.05)；與模型對照組同期比較，芪丹益肺通竅顆粒組及氯雷他定組給藥7、14 天評分均下降(P<0.05)。

表2 不同組間大鼠鼻部癥狀評分(分，

表3 不同組間大鼠的各種臟器系數(%)比較

3.3對AR大鼠血清IL-4和IFN-γ水平的影響(見表4) 與空白對照組比較，模型組大鼠血清中IL-4水平明顯升高、IFN-γ水平降低均(P<0.05)；與模型組比較，芪丹益肺顆粒組和氯雷他定組大鼠血清中IL-4水平降低、IFN-γ水平升高(均P<0.05)，但2個治療組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 不同組間大鼠血清IL-4、IFN-γ比較

4 討論

變應性鼻炎是I型變態反應介導的鼻腔黏膜高反應性疾病[1]，以突然和反復發作的噴嚏、鼻塞、清水樣涕、鼻癢為主要表現。目前普遍認為其發病機制是過敏原作用于機體，導致Th1/Th2失衡而引發的以鼻腔黏膜Th2免疫反應為主的炎性反應[11，13]。活化后的Th2細胞分泌的介質IL-4，促進體液免疫反應，IL-4是重要的促炎因子[12]，Th1細胞分泌的IFN-γ，可抑制Th2細胞的分化和功能，介導細胞免疫反應。

鼻鼽的發生與肺心兩臟密切相關[14]，古籍云“五氣入鼻，藏于心肺，心肺有病，而鼻為不利也”，心主血脈，肺主氣，氣為血之帥，血為氣之母，心肺發揮氣血運化功能，使鼻竅通利，若氣虛則血液運行無力、流動受阻，最終形成血瘀，血瘀與氣虛、氣滯常伴隨。田老[14-17]認為，鼻鼽發病多以氣虛為本，血瘀為標，因氣虛起病，因血瘀難愈，“氣虛血瘀，竅絡瘀阻”乃此病基本病機，治以肺心同治，益氣活血通竅，經方時用，由玉屏風散加味而成芪丹益肺通竅顆粒來治療效果佳。

芪丹益肺通竅顆粒以黃芪為君藥，白術、防風、川芎為臣藥，君藥黃芪，甘，微溫；歸脾、肺經，有健脾補肺、益衛固表，補氣升陽，利水消腫之功，為補氣之圣藥，而甘溫之性，補益肺脾之氣佳[18-19]。現代研究[20]表明，黃芪含有黃酮類、皂苷類、多糖類等多種有效成分，具有調節免疫、抗癌、抗病毒、神經保護、降糖，等諸多藥理學活性。徐江濤[21]等通過黃芪多糖對肺氣虛型AR大鼠模型影響的研究，得出黃芪多糖可能通過下調 TSLP、OX40L mRNA表達，抑制Th2細胞分化信號，減輕變應性鼻炎中Th2炎癥反應，緩解AR大鼠鼻黏膜炎性癥狀。髓源性抑制細胞在自身免疫性疾病等過程中發揮重要的作用。報道[22-24]顯示黃芪多糖可以降低宮頸癌、肺癌患者及荷瘤鼠脾臟中髓源性抑制細胞(MDSCs)水平，提高機體免疫功能。臣藥白術，味甘、苦，性溫， 歸脾、胃經，具有燥濕利水、補脾健胃、止汗、安胎等功效，主治脾虛泄瀉、食少肚脹、倦怠乏力、胎動不安等病癥[25]，為“脾臟補氣健脾第一要藥”。白術的主要化學成分[26]為揮發油、內酯及多糖，白術多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖及免疫調節等多種生物活性 。報道稱[25]，白術多糖可能對脾淋巴細胞培養體系中的 T、B 淋巴細胞具有選擇性作用，能促進 ConA 誘導的脾淋巴細胞轉化，但對 LPS 刺激的脾淋巴細胞轉化具有抑制作用。防風味辛、微甘，性溫，主歸膀胱、肝、脾經，具有解表祛風、勝濕之功效[27]。研究發現防風具有免疫調節、鎮痛、抗炎等作用[28]。臣藥川芎，味辛、溫，入心包經，是活血行氣的良藥。川芎嗪是從川芎中提取的生物堿類有效成分，研究發現[29-30]，其有保護內皮細胞、抗炎、抗氧化應激、抗血小板活化等作用。君藥黃芪與臣藥白術配伍對減緩氣道重塑進展有積極作用[31-32]，且該藥對補益肺脾之氣較單味藥的力量更強，效果更好[33]，可通過IL1β而發揮調控炎癥反應、氧化應激反應、血管新生治療COPD[34]。

本研究顯示，模型組大鼠較正常大鼠血清中IL-4水平明顯升高、IFN-γ水平降低均(P<0.05)；與模型組比較，芪丹益肺顆粒組和氯雷他定組證候表現明顯改善，鼻部癥狀評分降低，血清中IL-4水平降低、IFN-γ水平升高(均P<0.05)，但2個治療組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，說明芪丹益肺通竅顆粒可有效控制AR大鼠鼻癢、噴嚏等癥狀，其機制可能是下調IL-4水平與上升IFN-γ水平來糾正Th1/Th2失衡而對變應性鼻炎大鼠發揮治療作用，本研究為運用益氣活血通竅法治療變應性鼻炎提供了實驗依據。