布魯氏菌病的免疫逃逸機制及基因多態性的研究進展

蘇 霄，趙世剛，2

1 研究背景

布魯氏菌病又稱馬耳他熱，波狀熱，地中海熱等，是由布魯氏菌屬引起的全球嚴重的自然疫源性人獸共患病之一[1]。該病在我國被列為乙類法定報告傳染病，它在東北、內蒙古、西北等牧區曾廣泛流行，上世紀 70-80 年代末疫情趨于下降，但自 90 年代，發病人數逐年增多，成為我國發病數增長速度最快的傳染病之一, 近年來布魯氏菌病呈現由牧區向非牧區轉移，由職業人群向非職業人群擴散的趨勢,使我國疫情防治面臨嚴峻形勢[2]。由于缺乏有效的治療方法，該病容易遷延不愈，此文章的目的是收集該病慢性感染形成的可能原因，包括毒力因子、逃逸機制、機體免疫反應的新變化。此外，收集了與布魯氏菌病易感性及慢性感染形成有關的基因多態性的問題，這在以前的綜述中較少提及。

2 布魯氏菌病原學特征

布魯氏菌是一種革蘭染色陰性、需氧、非運動兼性細胞內寄生的短狀桿菌或球狀桿菌。布魯氏菌根據致病性和宿主的不同可以分為 6個種，即馬耳他布魯氏菌(羊種布魯氏菌，B.melltensis)、流產布魯氏菌(牛種布魯氏菌，B.abortus)、豬種布魯氏菌(B.suis)、綿羊附睪種布魯氏菌(B.ovis)、沙林鼠種布魯氏菌(B.neotormae)、犬種布魯氏菌(B.canis)[3]。造成人類感染的主要有3種：B.melitensis、B.abortus和B.suis.其中由大衛·布魯斯發現的布魯氏菌是引起人類布魯氏菌病的主要原因[4]。但仍有罕見的布魯氏菌屬能感染人類，例如從海洋生物分離的2種布魯氏菌種屬B.ceti(鯨類海洋布魯氏菌)和B.pinipialis(鰭足類海洋布魯氏菌)[5]。此外，還有菌株 BO1和菌株BO2，作為非典型菌株分別從患有乳房植入物感染的人類患者和肺炎患者的肺活檢中分離出來[6-7]。

3 布魯氏菌感染宿主時的免疫特性

在感染的最初1 h，很少有生物能夠在巨噬細胞內部氧自由基的攻擊下幸存。但布魯氏菌可以在巨噬細胞內部的吞噬體中存活并持續存在，從而導致慢性布魯氏菌病。布魯氏菌的致病性在很大程度上取決于入侵宿主的能力及在細胞內復制單位中繁殖的能力[8]。布魯氏菌具有不同的毒力因子，使細菌可以在胞內長期存活造成感染狀態。據報道，在體外模型中，有許多毒力因子參與了布魯氏菌的逃逸機制，這里僅報道在大多數體外和體內實驗模型中對形成長期感染有明顯作用的毒力因子。這些毒力因子的發現可能對開發疫苗具有至關重要的影響。

3.1 毒力因子

3.1.1脂多糖(lipopolysaccharide，LPS) 革蘭氏陰性菌外膜中存在的LPS是布魯氏菌的主要致病因子。LPS包含脂質A、寡糖核心和O抗原。在布魯氏菌屬中，脂質A比其他腸桿菌科中的脂質更長，導致其與TLR-4的相互作用顯著降低從而減少了促炎癥因子的產生，使其不易被免疫系統消滅[9]。根據LPS的O-抗原的不同，布魯氏菌屬可以分為粗糙型和光滑型。光滑型菌株通過與脂質筏相互作用可以抑制巨噬細胞中的吞噬體-溶酶體融合從而影響巨噬細胞的殺菌作用。LPS增強了對于抗菌素陽離子肽(如a-防御素、NP-2和乳鐵蛋白)以及一氧化氮(NO)[10]、自由基和溶菌酶的抗性，使具有非內毒素性質LPS的布魯氏菌在宿主的抗菌攻擊下表現的更穩定，并阻止免疫介體的合成[11]。因此，脂多糖是布魯氏菌滲透到宿主細胞和避免被免疫系統殺死的重要成分。

3.1.2BvrR/BvrS 布魯氏菌毒力相關調控(BvrS)和感覺(BvrR)蛋白組成布魯氏菌二組分調節系統。它對溶酶體中布魯氏菌的黏附、滲透、侵襲和逃逸起到了重要作用[12]。此外，該系統還控制細胞表面蛋白(例如Omp25和Omp22)的表達[13]。

3.1.3 IV型分泌系統相關毒力因子

3.1.3.1VirB操縱子編碼的IV型分泌系統(T4SS) T4SS參與布魯氏菌對宿主細胞的黏附，內化，細胞內運輸和復制過程。T4SS是一個多蛋白復合物家族，由12個跨越被膜的多蛋白復合物VirB1-12 構成，可以在細菌外膜上形成一個“管道”，當裝配完成后布魯氏菌就會向宿主細胞“注射”效應蛋白操控細胞的信號通路和應激反應。目前已經確定了11種IV 型分泌系統效應蛋白，其中有3種蛋白功能較清楚，Btp1 蛋白可以引發宿主免疫相關蛋白 E3 介導磷酸化 TIRAP 分子的降解。TIRAP 是 TLR2 和 TLR4 信號通路的關鍵分子，該分子的降解會弱化布魯氏菌感染過程中免疫應答信號的傳導，從而有利于胞內生存[14]。RicA和 CstA與自噬溶酶體和胞內運輸的形成有關[15]。T4SS還通過轉運效應分子和中和細胞內的酸性環境來促成布魯氏菌復制位的建立和細胞內存活。已經證明T4SS缺陷的突變布魯氏菌不能在小鼠模型體內建立持續感染。

3.1.3.2VirJ VirJ編碼一種參與細胞質復制的蛋白質，該蛋白質位于周質區域。這種蛋白質在兩種IV型分泌系統(SepA和Bpe123)中起著至關重要的作用。另外，它可以與VirB操縱子編碼IV型分泌系統(T4SS)的中心組件形成復合體，因此VirJ是分泌平臺的一部分[16]。

3.1.3.3LuxR 型轉錄調控子 LuxR 型轉錄調控因子主要對細菌密度感應系統的變化做出應答，其中VjbR 和BlxR對T4SS也產生影響。VjbR 能誘導 100 多個基因表達，其包括外膜蛋白、virB 操縱子、環 β-1,2 葡聚糖合成酶Cgs等[17]。另一LuxR 型調控因子 BlxR 影響 virB 操縱子的表達和鞭毛基因的合成[18]。

3.1.4環狀β-1,2-葡聚糖(CbG) CbG為布魯氏菌細胞內存活提供必需的滲透壓。這些葡聚糖在宿主細胞膜上的脂筏中起作用，并通過與溶酶體的融合來調節含有布魯氏菌的液泡成熟促進其逃逸。因此，這種毒力因子在布魯氏菌與脂筏的相互作用和布魯氏菌的復制中起作用[19]。

3.1.5熱休克蛋白60(Hsp60) Hsp60是布魯氏菌表面表達的伴侶蛋白家族的一員，在入侵前與巨噬細胞表面上一種細胞病毒蛋白PrPC結合，從而促進布魯氏菌與宿主細胞的黏附和細胞內復制[20]。

3.1.6布氏小體形成相關毒力因子 布魯氏菌容易造成慢性持續性感染的關鍵特性是其能夠適應細胞內營養不良、低氧、酸性pH和活性氧攻擊的環境。這主要得益于布魯氏菌可以在細胞內形成一種叫布氏小體的復制單位，在這個復制單位中，它可以生活在被感染的細胞中以完成感染周期。而布氏小體的形成主要得益于布魯氏菌中各種毒力因子的存在，下面對這些毒力因子做一概述。

根據所得數據，陰平是一個平調，陽平則是一個升調，上聲是一個高降調，去聲同樣是高降調，但調值差距比上聲要小，入聲歸入陰平和去聲。

3.1.6.1過氧化氫酶(CAT) 可以將H2O2氧化為H2O和O2從而保護細菌免受細胞內氧化劑的侵害[21]。

3.1.6.2超氧化物歧化酶(SOD) 可以將超氧化物分解成氧氣和過氧化氫H2O2從而排除內源性活性氧的毒性作用，保護布魯氏菌免受氧化殺傷[21]。

3.1.6.3尿素酶 可以將尿素水解成碳酸和兩分子氨從而降低所在環境的pH值，為布魯氏菌的生存提供適宜的酸性環境[22]。

3.1.6.4烷基過氧化氫還原酶(ahpc&D) 可以對布魯氏菌有氧代謝產生的H2O2和氫過氧化物進行解毒從而防止氧化和氮氧化物的損傷[23]。

3.1.6.5細胞色素氧化酶(cydDCAB) 表達與適應細胞內低氧張力環境相關的基因，防止ROS的產生并在布氏小體中起解毒作用，從而促進布魯氏菌在細胞內生長[24]。

3.1.6.6一氧化氮還原酶(norD)包含4種反硝化酶硝酸還原酶(Nar)、一氧化氮還原酶(Nir)、一氧化氮還原酶(Nor)和一氧化二氮還原酶(Nos)幫助布魯氏菌在低氧壓力下存活并緩解NO的毒性作用[25]。

3.1.6.7布魯氏菌毒力因子A(BvfA) 可以被調節以應對細胞內酸性PH或巨噬細胞的攻擊從而形成布魯氏菌在細胞內存活及復制的布氏小體[22]。

3.1.6.8Nramp1基因 在最初階段參與激活巨噬細胞和先天免疫應答，誘導多種對巨噬細胞有影響的蛋白[26]，將吞噬體的pH調節至酸性范圍。

3.2免疫逃逸策略 雖然在感染的第1小時內90%以上的布魯氏菌會被殺死，但仍有一部分會存活下來并在被感染的細胞中復制[27]。這主要得益于布魯氏菌利用多種策略來逃避免疫應答機制，從而在宿主體內建立持續感染。下面對這些策略做一概述。

3.2.1逃避先天性免疫 先天性免疫系統對早期控制細菌復制和成功根除細菌至關重要，但布魯氏菌采用“隱蔽”的策略來應對先天免疫系統，避免了模式識別受體(PRR)的識別和隨后強烈的炎癥反應[28]。布魯氏菌缺乏明顯的毒力因子，其表面的脂多糖(LPS)、脂蛋白、脂質、鞭毛等都是較弱的固有免疫誘導劑，可以在某種程度上逃避PRRs的識別[29]。如LPS中的脂質A相比腸桿菌科具有更長的脂肪酸鏈(C28)，因此大大減少了對TLR4的刺激并且減弱自身的毒性。VI抗原在LPS周圍形成的被膜可限制其與TLR4的接觸從而減少了對免疫系統的刺激[30]。LPS的O-抗原缺乏自由羥基，因此不能與補體C3結合，抑制了C3a和C5a的生成，造成C3補體系統的攻擊減少和促炎細胞因子的產生[31]。因為布魯氏菌的鞭毛缺乏激活TLR5的結構域從而無法激活由TLR5介導的炎癥反應[32]。這都為布魯氏菌控制布氏小體(Brucella-containing vacuole, BCV)到達內質網(endoplasmic reticulum, ER)處建立復制小室提供了時間。

3.2.2 調節獲得性免疫

3.2.2.1干擾細胞因子產生 在感染的后期，適應性免疫是機體清除感染，建立具有記憶功能特異性免疫的重要途徑。然而布魯氏菌進化出“干擾”的策略，干擾從先天性免疫系統到獲得性性免疫系統的信息傳遞，從而影響DCs的功能以逃避宿主的免疫反應。已有研究表明，感染布魯氏菌的DC中MHC Ⅱ類分子、CD86和CD80的表達量降低，降低了其向特異性T細胞提呈抗原的能力從而抑制了促炎細胞因子(如IL-12、TNF-α)的分泌[33]。干擾素-γ介導的I型免疫反應對于清除布魯氏菌是必不可少的。最近的研究表明，Btp1/TcpB、BrLPS和PrpA是與宿主免疫機制相互作用的重要免疫調節分子，其有能力抑制干擾素γ的分泌，增加IL-10的分泌，從而影響Th1型免疫反應[34]。除此之外，布魯氏菌通過減少IL-12的分泌和阻止受感染的DC激活T細胞來干擾保護性Th1免疫反應的建立[35]。并且，未成熟的DC與CD4+幼稚T細胞的接觸可能誘導調節性T細胞(Treg)活動，并通過轉化生長因子β阻止Th1型反應[36]。這些發現表明，布魯氏菌可以通過干擾細胞因子的分泌，以逃避適應性免疫。

3.2.2.2干擾模式識別受體 模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)是一類主要表達于固有免疫細胞表面可識別一種或多種PAMP的識別分子(包括表面識別受體家族TLR、胞內受體家族如NOD樣受體家族和AIM2受體)。TLR信號通路是產生促炎性細胞因子的主要信號通路。趙世剛等人證實在布魯氏菌病急性期TLR相關識別受體及分子通路與慢性期發生了顯著變化[37]。布魯氏菌利用其分泌蛋白干擾受感染DCs的TLR路徑，以阻礙DCs的成熟。布魯氏菌分泌的效應蛋白TcpB/Btp1可以誘導信號蛋白MAL的泛素化降解從而干擾TLR2和TLR4信號傳導，以此阻斷由其激活的炎癥反應。另外TcpB/Btp1還可以抑制樹突狀細胞成熟，阻斷MyD88信號通路，以減少TNF-α和IL-12的分泌，并降低慢性感染期間的CTL細胞毒性利于細菌的胞內寄生和繁殖[35]。最近幾年的研究發現胞內受體家族如NOD樣受體家族和AIM2受體在識別和清除布魯氏菌的過程中也起到了重要的作用。但相關研究大多基于基礎實驗未在人體得到證實。TLR誘導IL-1b和IL-18細胞因子的前體形式表達，此后，依賴NLR的caspase-1激活從而調節其蛋白水解過程和釋放[38]。最近，AIM2被確定為一種新型的細胞內受體，參與病毒和細菌感染過程，它識別胞質內病原體DNA從而激活炎癥小體。鑒于布魯氏菌的胞內生存特性，胞內識別受體可能在形成布魯氏菌慢性感染過程中起到重要作用，對其調控因素的研究可能有助于防止布魯氏菌病由急性期向慢性期轉變。

3.2.3自噬途徑的選擇性顛覆 自噬是一種重要的宿主防御機制，可以用以消除胞內寄生菌。然而，有些細菌可以改變宿主細胞自噬來保護自身的生存或抑制自噬體的形成。最近的證據表明自噬相關蛋白在內質網衍生型BCV(rBCV)的形成中發揮關鍵作用，并有助于其完成細胞內生命周期，布魯氏菌顛覆了宿主細胞膜的運輸途徑[39]。依賴Yip1A的IRE1α的激活上調了Sar1和COPII的表達，導致依賴ATG9和WiPI的大空泡形成[40]。這些發現表明布魯氏菌病中IRE1α的表達促進了自噬起源空泡的形成，這些空泡將含有布魯氏菌的液泡(eBCV)轉化為rBCV[41]。這些發現表明，自噬蛋白的啟動在rBCV向aBCV的轉化過程中起重要作用，而Yip1A在布魯氏菌的復制和rBCV的生物發生過程中也是必需的。因此，“顛覆”自噬是布魯氏菌對抗宿主免疫應答的重要策略。

3.2.4抑制細胞凋亡 細胞凋亡指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞程序性死亡。抑制凋亡是布魯氏菌維持細胞內復制生態位的重要策略。布魯氏菌以特定的鈣依賴性方式顯著提高了Nedd4活性，進而提高了鈣蛋白酶2的降解并抑制巨噬細胞凋亡[42]。A20的上調抑制了NF-κB信號通路，從而抑制了caspase-8依賴性的巨噬細胞凋亡，達到了促進細菌的細胞內生長的目的[43]。此外，受布魯氏菌感染的中性粒細胞和單核細胞具有顯著上調各種黏附分子(如CD106和CD54)的能力，從而抑制了這些細胞的凋亡[44]。總的來說，這些證據表明抑制凋亡是布魯氏菌逃避免疫反應完成細胞內復制的一種策略。

3.2.5小分子非編碼RNA在布魯氏菌感染中的作用 miRNAs是小分子非編碼RNA的一部分，參與調控基因表達、細胞凋亡和信號轉導。有證據顯示，布魯氏菌miRNAs可能在細菌逃逸免疫反應中起著重要的作用。Casewell等報道B.abortusmiRNAs、abcR1和abcR2在布魯氏菌致病性和慢性感染中發揮重要作用[45]。有證據顯示在受布魯氏菌感染細胞中miR-92a、miR-93、let-7b、miR-1981和miR-181b等幾種miRNAs與模擬感染細胞有差異表達，并認為這些miRNAs可能參與了免疫應答機制、自噬和凋亡[46]。Budak等人發現與急性布魯氏菌病相比，慢性病患者的CD4+T細胞中28種miRNA的表達水平發生了顯著改變，其中有27種以某種方式參與了MAPK信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調節、內質網的內吞作用和內質網中的蛋白加工等過程，但在急性病例中未表達[47]。這些發現都暗示了miRNA可能在慢性布魯氏菌病形成過程中起作用。

4 宿主免疫機制及新發現

4.1先天免疫反應 先天免疫反應是針對病原體的非特異性反應。在針對布魯氏菌的初始免疫反應中，巨噬細胞和樹突狀細胞首先吞噬細菌然后將病原體衍生肽呈遞給幼稚的T細胞以促進適應性免疫。在感染部位，中性粒細胞在先天免疫應答的早期階段起到作用，在吞噬過程中，其向吞噬體遞送抗菌顆粒，當顆粒融合后，釋放出裂解酶和活性氧，從而殺死布魯氏菌。先天性淋巴細胞包括自然殺傷(NK)細胞，NK T細胞和CDT細胞能夠識別不受MHC限制的非肽抗原[48]，通過促進顆粒和Fas配體介導的細胞毒性，活化巨噬細胞，產生IFN-c以及分泌顆粒溶素和cathelicidin抗菌肽來抑制布魯氏菌在細胞內存活。Fas-FasL的相互作用會導致被感染的巨噬細胞死亡[49]。最近，已證明布魯氏菌直接與血小板相互作用并觸發其活化。血小板通過促進布魯氏菌侵襲巨噬細胞而參與早期感染。它們還可以與感染的巨噬細胞建立復合物并充當載體。此外，血小板在巨噬細胞感染期間增加IL-1b、TNF-α、IL-8和巨噬細胞化學引誘子蛋白-1(MCP-1)的水平，并降低IL-10的水平。血小板可以調節布魯氏菌介導的巨噬細胞感染，并促進炎癥發生[50]。

4.2適應性免疫 適應性免疫是消除布魯氏菌的第二道防線。吞噬細胞吞噬布魯氏菌后，將MHC-I和II相關的細菌肽呈遞給T淋巴細胞，T細胞通過其表面的受體識別肽-MHC復合物從而被激活，隨后在抗原呈遞細胞(APC)分泌的IL-12作用下，由幼稚T細胞分化為T輔助1型(Th1)細胞。Th1細胞產生的IL-2和IFN-c對于清除布魯氏菌至關重要。IFN-c負責激活巨噬細胞的抗菌能力，提高APC上抗原呈遞和共刺激分子的表達，動員細胞毒性T淋巴細胞(CTL)介導的細胞毒性和細胞凋亡[51]。因此，IFN-c是引發針對布魯氏菌免疫應答的關鍵細胞因子。Th1反應的任何紊亂都可能導致慢性布魯氏菌病的發生并導致不良預后的發生。B淋巴細胞是人體免疫功能的關鍵細胞，由于其具有免疫調節作用，因此被認為是布魯氏菌最常見的細胞內生態位。Goenka等人認為在布魯氏菌感染過程中B細胞可能增加IFN-c的產生并清除布魯氏菌，其還發現B細胞中IL-10和TGF-b在清除布魯氏菌感染過程中起到積極作用[52]。鑒于之前研究顯示慢性感染中TGF-b會增加，而布魯氏菌感染的B細胞會產生大量的TGF-b，證明B細胞與慢性布魯氏菌病可能有關[53]。在布魯氏菌感染的早期階段，Th1細胞表達高水平，而在隨后的階段，TH2細胞表達水平增高，繼而產生IL-4、5、10和13[54]，在慢性感染的階段檢測到高水平的IL-5和TGF-b以及低水平的IFN-c。因此，免疫反應中細胞因子的極化表現或許可以表明布魯氏菌病的進展過程[55]。Ganji等人提出，與急性布魯氏菌病相比，慢性布魯氏菌病中具有CD25/FoxP3β表型的調節性T細胞(Tregs)減少，調節性T細胞數量的減少導致了T細胞無反應和慢性感染的發生[56]。有報道顯示，在活躍的人布魯氏菌病中，調節性T(Treg)細胞數量增加，并且在成功治療后下降[57]。另一方面，由于共刺激信號不足，慢性感染患者的CD25/Fox P3βTreg細胞顯著減少，導致無法發揮作用[58]。

5 基因多態性與布魯氏菌病的相關性

細胞因子基因編碼區和非編碼區的多態性可能影響細胞因子的產生水平，從而對免疫反應產生影響，這可能導致慢性布魯氏菌病的發生。有研究已經鑒定出易患布魯氏菌病的風險基因或可能的基因多態性，例如TGF-b1、TNF-α(308)、IL-6(174)和IFN-c(t874)。TGF b1和IL-10與布魯氏菌病的耐藥性相關，HLA-B27與慢性布魯氏菌病有關[59]。此前的綜述中有關報道較少，在此對與布魯氏菌病形成可能相關的基因多態性的問題做一簡單羅列。見表1。

表1 分析單核苷酸多態性(SNPs)與布氏桿菌病的關聯性和特性

6 結論與展望

這篇綜述旨在對慢性布魯氏菌病的成因提供片面的見解。盡管布魯氏菌進入人體后會激活免疫反應，但得益于多種毒力因子和逃逸策略的存在，它成功逃避了免疫反應，很容易造成持續感染。由于缺乏可靠的診斷和治療方法，布魯氏菌病經常復發，慢性布魯氏菌病也不時發生，目前使用的藥物的副作用也使布魯氏菌病成為嚴重的健康問題。盡管科研界對布魯氏菌的不同方面進行了許多研究，包括新的毒力因子、適應能力、細胞內運輸、對呼吸暴發的抵抗力、滲透機制、逃避宿主免疫系統和基因多態性，然而關于慢性感染的發病機制仍然不甚明了，新的研究發現細胞內受體(NOD樣受體)在清除感染中可能起到積極作用，對此進行研究也許可以改進治療策略，甚至可以開發出有效的人類疫苗。

利益沖突：無