徐州市耐多藥結核耐藥分析及分枝桿菌基因突變特征研究

劉加彬,張瑞梅,劉成永

耐藥結核的出現，給中國乃至世界的結核病診療與控制工作帶來嚴峻挑戰。世界衛生組織列出的30個高結核病負擔國家在全球的病例中，印度占27%，中國占9%，中國位列全球第二[1]。中國結核病報告發病人數始終位居法定乙類傳染病前列[2]。研究發現結核分枝桿菌異煙肼(INH)耐藥與katG、inhA、aphC，利福平(RFP)與rpoB等相關耐藥基因突變有關，并且不同的國家和地區結核分枝桿菌耐藥相關基因的突變特點也不相同[3]。

我們的研究就是基于聚合酶鏈式反應(PCR)和反向點雜交(RDB)相結合的基因芯片技術,隨機抽取徐州地區耐多藥結核(MDR-TB)分枝桿菌，分析和發現本地區MDR-TB耐藥情況和相關基因突變特征，為耐多藥結核的快速診療和精準控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1數據來源 研究涉及的MDR-TB菌株115株，敏感菌株66株來自徐州市傳染病醫院、徐州市疾控中心及徐州市10縣(市)、區結核病監測點實驗室。菌株的傳代、培養和保存均由徐州市傳染病院完成。結核分枝桿菌標準株 H37RV 由中國結核病控制中心臨床中心參比室提供。

1.2結核分枝桿菌改良羅氏比例法藥物敏感試驗[4]改良羅氏比例法培養基內含藥濃度按照中國防癆協會推薦的耐藥標準：INH(0.2 μg/mL)、RFP(40 μg/mL)、SM(4 μg/mL)、EMB(2 μg/mL)、KM(30 μg/mL)、OFX(2 μg/mL)。

1.3結核分枝桿菌鑒定 用對硝基苯甲酸(PNB)法[4]

1.4藥敏培養基[4]抗癆藥物異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RFP)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、氧氟沙星(ofloxacin，OFX)、鏈 霉 素(SM)、卡那霉素(kanamycin，KM)均由徐州市傳染病院提供。

1.5結核分枝桿菌耐多藥基因芯片分析[5]結核桿菌(TB)全基因組有4 411 529 bp,約包括4 000個基因。研究發現TB耐藥性的發生與其基因突變相關。正常情況下，TB的KatG蛋白和InhA蛋白使異煙肼活化成異煙酸，使之具有殺菌的能力。當katG、inhA基因發生突變時，過氧化氫-過氧化物酶、烯酰基還原酶活性下降或喪失，阻止異煙肼變成活性形式，從而導致TB對異煙肼產生不同程度的耐藥。

利福平的耐藥性95%以上是由編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因突變引起，突變均發生在rpoB509～533位的25個氨基酸(75 bp)組成的區域內。rpoB基因是細菌RNA聚合酶β亞基的編碼基因。當其中81個堿基的核心區域-耐利福平決定區(RRDR)發生突變時，包括點突變或短的插入、缺失突變等，利福平不能與細菌RNA聚合酶β亞基結合，因而細菌表現為對利福平的耐受性。

本系統采用了聚合酶鏈式反應(PCR)和反向點雜交(RDB)相結合的基因芯片技術。設計引物擴增目的基因，引物一端標記有生物素，擴增好的產物都帶有生物素標記。然后擴增好的目的基因片段與膜芯片上的探針特異結合，再通過鏈霉親和素-過氧化物酶復合物與生物素結合，復合物在TMB作用和過氧化氫的催化下發生顯色反應，擴增產物有與探針結合的位置都會產生藍色圓點。MTB耐藥突變基因檢測芯片來自深圳亞能生物。

1.6芯片法檢測位點[6]臨床疑似肺結核患者分離培養結核分枝桿菌核酸的定性檢測INH的katG、inhA和aphC基因各檢測1個位點和RFP的rpoB基因檢測6個位點。

1.7樣本選擇 對徐州地區2015-2018年結核病實驗室耐多藥菌株采取單純隨機抽樣，結合徐州地區耐多藥率計算樣本數。數據錄入采取EXCEL軟件，數據統計采用SPSS 20.0進行t檢驗。

2 結 果

2.1耐多藥情況 115例MDR-TB菌株耐藥情況有9種組合，主要是以耐INH+RFP組合為主，比例為47.83%，其次為耐INH+RFP+SM組合，比例為20.00%，其他組合均占一定比例，見表1。

表1 徐州市耐多藥菌株耐藥分析

2.2 基因突變情況

2.2.1INH相關基因katG、inhA及aphC變情況分析 115例MDR-TB菌株檢測出無基因突變14株，基因突變株101株，突變率87.83%。INH相關基因突變類型、例數和突變率分別為katG基因74例(64.35%)、inhA基因4例(3.48%)、katG+inhA雙基因14例(12.17%)、katG+aphC雙位點突變12.17%。見表2。在比例法研究敏感株66例中，有6例發生基因突變，突變率9.09%，主要突變基因inhA3例(4.55%)、aphC3例(4.55%)，見表3。MDR-TB菌株和敏感株總體變異率均數比較(t=107.56，P<0.05)，二者差異有統計學意義。單個基因變異率均數比較katG(P<0.05)，二者差異有統計學意義。inhA基因(t=5.04，P>0.05)、aphC基因(t=0.73，P>0.05)，二者差異無統計學意義，見表3。

表2 徐州市MDR-TB菌株INH相關基因突變分析

表3 徐州市MDR-TB菌株和敏感株的基因突變統計分析(INH)

2.2.2RFP相關基因rpoB突變分析 115例MDR-TB菌株檢測出無基因突變16株，基因突變株99株，突變率86.09%。耐RFP 的相關rpoB基因突變位點類型和例數分別為 單531位點 52例(45.22%)、單516 位點 10例(8.70%)、單526位點 2例(1.74%)，531+516雙位點突變16例(13.91%)、531+513雙位點突變14例(12.17%)、516+533雙突變位點1例(0.87%)。531+516+513三位點突變4例(3.48%),見表4。在比例法研究敏感株66例中，有8例發生基因突變，突變率12.12%，主要突變單513位點、單526位點，見表5。MDR-TB菌株和敏感株總體變異率均數比較(t=94.92，P<0.05)，二者差異有統計學意義，531(P<0.05)、516(P<0.05)、533(P<0.05)二者比較差異均有統計學意義。513(t=5.04，P>0.05)、526(t=2.43，P>0.05)二者比較差異均沒有統計學意義。512二者均未檢出突變，見表5。

表4 徐州市MDR-TB菌株RFP相關基因突變分析

表5 徐州市MDR-TB菌株和敏感株的基因突變分析(RFP)

2.2.4MDR-TB菌株基因突變初復治分層分析 通過對115例MDR-TB菌株以患者初復治分層分析，二者無論是異煙肼，還是利福平，突變情況比較僅inhA(t=4.06，P<0.05)突變有統計學意義，見表6。

表6 徐州市MDR-TB初復治患者菌株基因突變變化統計分析

3 討 論

耐多藥結核病的發生和流行，無論是對中國還是世界的結核病控制與診療帶來挑戰。在WHO比爾·蓋茨項目資金的支持下，為MDR-TB患者實施了免費醫療，耐多藥結核發病率有所下降，但形勢依然嚴峻。

本研究結果發現耐多藥有9種組合，主要是以耐INH+RFP組合為主，比例為47.83%，其次為耐INH+RFP+SM組合，比例為20.00%，其他組合均占一定比例。這結果與其他地區有差異，主要原因與徐州地區的化療方案有關，席向宇等[10]研究也發現這一現象。

本研究利用MTB耐多藥突變基因檢測芯片檢測了徐州市115株MDR-TB的INH相關katG、inhA及aphC因。115例MDR-TB的耐INH相關檢測出無基因突變株14株，基因突變株101株，突變率87.83%。INH相關基因突變類型及例數分別為katG基因74例(64.35%)、inhA基因4例(3.48%)、katG+inhA雙基因14例(12.17%)、katG+aphC雙位點突變12.17%。與66例敏感株發生6例突變，總突變率9.09%。主要突變基因inhA3例(4.55%)、aphC3例(4.55%)，二者差異有統計學意義，這充分說明耐多藥基因突變的客觀性，檢測突變基因對臨床用藥指導有明顯的指導意義。katG基因單位點突變率(64.35%)與浙江地區[11](69.3%)等報道相似；與中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核室陳燕等[3]研究(84.0%)、深圳地區[12](84.6%)、福建[13]等地報道區別較大，這說明katG315 突變存在一定的地區差異。katG+inhA基因(12.17%)、katG+aphC雙位點突變12.17%突變與陳燕等[3]研究也有比較大的區別。無論單個基因還是聯合多個基因變異均表現地區間差異，原因應該進一步分析。MDR-TB菌株和敏感株總體變異率均數比較(t=107.56，P<0.05)，二者差異有統計學意義。katG基因(P<0.05)二者差異有統計學意義。inhA基因(t=5.04，P>0.05)、aphC基因(t=0.73，P>0.05)，二者差異無統計學意義。研究表明katG基因突變相對穩定，有較強的臨床應用價值，可作為耐藥診斷的指標。inhA、aphC因突變表現出不穩定性，僅對臨床有參考意義。

本研究利用MTB耐多藥突變基因檢測芯片檢測徐州市115株MDR-TB的RFP相關rpoB基因。115株MDR-TB菌株檢測出無基因突變16株，基因突變株99株，突變率86.09%。RFP相關rpoB基因突變位點類型和例數分別為單531位點52例(45.22%)、單516位點 10例(8.70%)、單526位點 2例(1.74%)、單533、513、512位點沒有檢出，531+516雙位點突變16例(13.91%)、531+513雙位點突變14例(12.17%)、516+533雙突變位點1例(0.87%)。531+516+513三位點突變4例(3.48%)。突變以531、516位點為主，531+516、531+513雙位點突變，531+516+513三位點突變均有檢出，徐州市RFP相關rpoB基因突變位點類型表現出多樣性。耐多藥株與敏感株突變位點也存在差異，敏感株發生突變的513、526位點，在耐藥株中很少檢測到。本研究單531位點(45.22%)與陳燕等[3]研究檢測結果(49.3%)相似，但其他單位點、多位點差異較大表現出地區差異。敏感株66例中，有8例發生基因突變，突變率12.12%，主要突變單513位點、單526位點，與陳燕等[3]研究敏感株的無任何突變的檢測結果有差異。MDR-TB菌株和敏感株總體及單個位點變異率均數比較t=94.92，P<0.05，二者差異有統計學意義，531(P<0.05)、516(P<0.05)、533(P<0.05)二者比較差異均有統計學意義。513(t=5.04，P>0.05)、526(t=2.43，P>0.05)，二者比較差異均沒有統計學意義。512二者均未檢出突變，本研究表明rpoB基因531、516、533位點突變相對穩定，有較強的臨床應用價值，可作為耐藥診斷的指標。513、526、512位點突變表現出不穩定性，僅對臨床有參考意義，其應用價值有待進一步研究。

綜上所述，徐州市MTD-TB患者耐藥情況地區特征清晰，與耐INH或RFP相關基因突變客觀存在，并表現出多態性和地區性。與耐INH相關基因katG、與耐RFP相關基因rpoB531、516和533位點基因突變穩定，可為MTD-TB診斷指標體系建立提供科學依據，將為徐州市MTD-TB精準而快速診療和控制提供幫助。

利益沖突：無