組織蛋白酶C和腫瘤壞死因子α在人冠脈組織中的表達及其與冠心病的相關性研究*

張 瓊，萬昌武，于燕妮，夏 冰，劉江金，張橋軍，李 竹，王承飛，戴佳琳，王 杰

（貴州醫(yī)科大學法醫(yī)學院，貴州貴陽 550001）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary athero?sclerotic heart disease，CHD）簡稱冠心病，是一種受多種復雜因素影響的慢性炎癥性疾病，其主要特征是動脈粥樣硬化斑塊形成，內(nèi)膜增厚，管腔不同程度狹窄，心肌缺血、缺氧，從而引起心臟結構和功能的紊亂。目前冠心病已成為全球首要的死亡和致殘病因［1-2］，其病死率高達心血管疾病總死亡率的80%［3］，已經(jīng)嚴重危害到人類的身心及精神健康。

組織蛋白酶（cathepsin）是在溶酶體中廣泛表達的一大類水解蛋白酶，目前已發(fā)現(xiàn)20 余種，人類組織蛋白酶共有11 種（組織蛋白酶B、C、F、H、K、L、O、S、V、W 和X）［4］，其中，組織蛋白酶C（cathepsin C，CTSC），也稱為二肽基肽酶I（dipeptidyl peptidase I，DPPI），屬于半胱氨酸類別的組織蛋白酶，主要在髓細胞、細胞毒性T 淋巴細胞、肥大細胞、中性粒細胞和巨噬細胞及其前體細胞等免疫細胞中廣泛表達［5-7］，其主要的生理功能是通過激活促炎性顆粒相關絲氨酸蛋白酶而促進炎癥反應［8］。2015年，Herías等［9］首次提出CTSC 與動脈粥樣硬化的關系，在人頸動脈粥樣硬化斑塊中檢測到CTSC 的表達量呈上升趨勢。另外，在其小鼠模型中，造血細胞中CTSC 的缺乏可緩解動脈粥樣硬化病變的形成進程。同屬半胱氨酸家族的組織蛋白酶S、K 和L 等［10-12］在動脈粥樣硬化疾病等心血管疾病中的研究已相對比較成熟［13］，然而CTSC 在人心血管疾病尤其是在冠心病中的研究目前較為少見。

腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNFα）是由活化的單核巨噬胞分泌的一種炎癥細胞因子，主要介導人體免疫反應和炎癥反應，其血清水平可能反映人動脈粥樣硬化斑塊的嚴重程度和穩(wěn)定性［14］。在劉清霞等［15］的研究中，TNF-α 的陽性表達隨斑塊不穩(wěn)定性增加而增強。目前尚未見到關于CTSC 和TNF-α 在冠心病中的相關性研究，因此本研究將檢測人冠狀動脈組織中CTSC 和TNF-α 的表達，分析兩者之間的關系并探討兩者在冠心病中的可能作用，以期為冠心病的預防和治療提供參考資料。

材料和方法

1 研究對象

收集貴州醫(yī)科大學法醫(yī)司法鑒定中心2018 年10 月～2019 年12 月的冠心病死亡案例52 例和無任何心血管疾病的意外死亡案例25 例。嚴格按照以下納入標準和排除標準：冠心病組納入標準：（1）尸體常溫保存不超過24 h 或冷凍保存不超過3 d，室溫解凍24 h；（2）冠狀動脈內(nèi)膜粥樣斑塊形成；（3）病理組織學確診為冠心病的死者；對照組納入標準：（1）尸體常溫保存不超過24 h 或冷凍保存不超過3 d，室溫解凍24 h；（2）高墜、交通事故和電擊等意外事故造成的死亡；（3）病理組織學檢查未發(fā)現(xiàn)任何心臟疾病及冠脈狹窄。對照組和冠心病組排除標準：組織自溶、腐敗；病理組織學檢查顯示有高血壓性心臟病、肥厚性心肌病等其他心臟疾病死亡案例。本研究所有案例經(jīng)過貴州醫(yī)科大學倫理委員會認可（批件號：2018-60-01），并有家屬簽署知情同意書。

收集的冠狀動脈組織均用液氮保存，用冰的PBS 洗凈后取斑塊最明顯且血管內(nèi)膜最厚的部位將每段冠狀動脈組織剪成80～100 g 的若干小段，液氮速凍后立即放入?80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 主要試劑和儀器

CTSC 多克隆抗體（Abcam）；TNF-α 多克隆抗體（Immunoway）；PV-6000 兔/鼠超敏二步法免疫組織化學檢測試劑和DAB 顯色試劑盒（中杉金橋公司）；鼠抗人β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（Abbkine）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術）。

3 方法

3.1 冠狀動脈組織學形態(tài)觀察與分析 所收集的冠狀動脈組織用4%中性甲醛液固定1 周后進行石蠟包埋、切片（4 μm）并制片，蘇木素-伊紅（HE）染色后中性樹脂封片，用EasyScan 數(shù)字切片掃描與應用系統(tǒng)（中國麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）掃描，并對其進行采圖，用Image-Pro Plus 6.0 測量冠狀動脈內(nèi)膜厚度和纖維帽厚度，并計算管腔狹窄程度。

3.2 Western blot 法檢測CTSC 和TNF-α 的蛋白表達 ?80℃冰箱取出備好的實驗樣本，加液氮研成粉末勻漿，低溫離心機4℃、13 225×g提取蛋白上清液，用紫外分光光度計測量蛋白濃度，10%分離膠和5%濃縮膠進行SDS-PAGE，將蛋白轉至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，PBS搖床清洗3次，每次5 min，孵育Ⅰ抗［β-actin 和TNF-α 抗體（1∶2 000），CTSC 抗體（1∶1 000）］，4℃冰箱過夜，回收Ⅰ抗，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG（1∶5 000），孵育1 h后經(jīng)Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)顯色成像，用ImageJ 分析軟件測量各條帶的灰度值并進行分析。每組數(shù)據(jù)均為3次獨立重復試驗結果。

3.3 免疫組織化學染色法檢測CTSC 和TNF-α 的表達與細胞定位 4%中性甲醛固定新鮮冠狀動脈組織，石蠟包埋并切片（4 μm），60℃烤箱烤片1.5 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水合后滴加3%過氧化氫封閉抗原，高壓修復抗原3 min，孵育Ⅰ抗［CTSC 和TNF-α抗體（1∶100）］，滴加PBS 緩沖液作陰性對照，4℃冰箱孵育過夜，室溫孵育辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠/兔IgG，滴加DAB 顯色液，蘇木素復染細胞核，在光學顯微鏡下觀察CTSC 和TNF-α 的陽性表達。陽性染色定位：排除非特異性染色及邊緣效應后，光鏡下組織以黃色、棕黃色和棕褐色為陽性表達，并觀察陽性染色在細胞內(nèi)的定位和分布特點。400 倍鏡下采集圖片，Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件測量所染組織切片陽性表達的總面積和總吸光度，并根據(jù)公式計算平均吸光度。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，兩組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料用卡方檢驗。指標間相關性分析采用Pearson 積矩相關系數(shù)檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 案例基本資料

本研究收集到因冠心病死亡者52 例，其中男性32 例，女性20 例，年齡32～70 歲，平均年齡（56.9±9.7）歲；因意外事故（如高墜、電擊、交通事故等）造成死亡25 例，其中男性15 例，女性10 例，年齡25～59歲，平均年齡（42.3±8.9）歲。

2 冠狀動脈組織形態(tài)學分析

對照組冠狀動脈內(nèi)膜完整、無增厚，無泡沫細胞堆積，管腔未見狹窄，血管平滑肌細胞排列整齊，中膜未見受壓變薄現(xiàn)象；與對照組相比，冠心病組動脈粥樣硬化斑塊形成，內(nèi)膜不規(guī)則增厚，內(nèi)膜下可見大量泡沫細胞堆積形成較大的脂質池，纖維帽結構明顯，中膜明顯受壓變薄，血管腔呈不同程度偏心性狹窄，見圖1。

Figure 1.Histomorphological changes of the coronary artery tis?sues（HE staining，scale bar=300 μm）.A：control group；B：CHD group.圖1 冠狀動脈的組織形態(tài)學變化

對兩組樣本的形態(tài)學指標進行測量分析，結果顯示，與對照組相比，冠心病組內(nèi)膜厚度增加，纖維帽變厚，管腔明顯狹窄（P＜0.05），見表1。

表1 冠狀動脈形態(tài)學指標的比較Table 1.Comparison of morphological indexes of coronary artery lesion（Mean±SD）

3 冠狀動脈組織中CTSC和TNF-α蛋白表達水平

Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，冠心病組中CTSC 和TNF-α 的表達水平均顯著升高（P＜0.05），見圖2。

4 冠狀動脈組織中CTSC 和TNF-α 蛋白的細胞定位和吸光度的變化情況

對照組未見CTSC 和TNF-α 陽性表達，冠心病組CTSC 和TNF-α 陽性表達均主要在泡沫細胞胞質中，陽性表達呈棕黃色或棕褐色，見圖3。

用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析檢測血管內(nèi)CTSC 和TNF-α 蛋白表達的平均吸光度，結果顯示，與對照組比較，冠心病組CTSC 和TNF-α 陽性表達水平顯著增高（P＜0.05），見表2。

5 CTSC和TNF-α的相關性分析

用Pearson 積矩相關系數(shù)檢驗法對所測量的CTSC 和TNF-α 的平均吸光度進行相關性分析，結果顯示，冠心病組CTSC 和TNF-α 的表達水平呈顯著正相關關系（r2=0.743，P＜0.05），見圖4。

Figure 2.The protein expression levels of CTSC and TNF-α were detected by Western blot.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group.圖2 CTSC和TNF-α的蛋白表達情況

Figure 3.The expression of CTSC and TNF-α in coronary atherosclerotic lesions（immunohistochemical staining，scale bar=50 μm）.A，D：control group；B，C，E，F(xiàn)：CHD group.圖3 冠狀動脈粥樣硬化病灶內(nèi)CTSC和TNF-α的表達

表2 冠狀動脈病變中CTSC和TNF-α蛋白表達的平均吸光度Table 2.Mean absorbance of the expression of CTSC and TNF-α proteins in coronary artery lesions（Mean±SD）

討 論

冠心病是一種發(fā)病率和死亡率較高的心血管疾病［16］，其主要病理特征是冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成。識別更多的生物標志物，對于了解冠心病的發(fā)生發(fā)展及診斷治療具有重要意義。本課題組在前期針對一組冠心病案例的冠狀動脈組織進行蛋白質組學定量分析，識別了256 個差異表達蛋白，其中組織蛋白酶家族成員在核心網(wǎng)絡中具有關鍵作用。組織蛋白酶家族多數(shù)成員參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展［17］，但是關于CTSC 與人冠心病冠狀動脈粥樣硬化的報道較少。CTSC 作為組織蛋白酶家族成員之一也是差異表達蛋白，相較于正常組，其表達量顯著升高，提示CTSC 在冠心病的發(fā)病機制中可能發(fā)揮著一定的作用。CTSC 是一種較保守的四聚體半胱氨酸類蛋白酶，其主要作用是降解細胞內(nèi)不需要的蛋白質以及激活免疫和炎癥細胞內(nèi)絲氨酸蛋白酶［18］。CTSC 在多種疾病中發(fā)揮作用，如常染色體隱性遺傳性疾病Papillon-Lefèvre 綜合征中CTSC基因位點的突變［19］、神經(jīng)炎癥的反應進程［20］、多種惡性腫瘤細胞的增殖、轉移和凋亡等［21］。近年來的研究顯示在動脈粥樣硬化的血管內(nèi)存在CTSC 表達異常［9，22］，并促進斑塊的形成，如在小鼠模型中，CTSC 的缺陷能夠減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展進程［22］，提示CTSC 可能參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。但以上研究主要局限于人頸動脈及動物實驗，因此本研究進一步檢測發(fā)生粥樣硬化的冠狀動脈CTSC 表達水平，結果顯示粥樣硬化冠狀動脈組CTSC 表達顯著升高，且CTSC 陽性表達主要分布在泡沫細胞，提示冠狀動脈粥樣硬化病灶內(nèi)存在CTSC 表達異常并與泡沫細胞的形成有關，推測CTSC 在冠心病動脈粥樣硬化中表達升高可能會影響斑塊的形成及其穩(wěn)定性。一項對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究顯示，CTSC 通過激活蛋白激酶C/p38-MAPK/NF-κB 信號通路誘導小膠質細胞向M1極化，導致炎癥因子釋放增加，從而促進神經(jīng)炎癥的發(fā)展［20］。Alam 等［23］的一項研究也顯示CTSC 在巨噬細胞中的表達上調(diào)且可以促進巨噬細胞的M1極化，增加炎癥因子的釋放，從而增強炎癥反應。

Figure 4.Correlation scatter diagram between CTSC and TNFα.The horizontal and vertical axes represent the mean absorbance（MA）of CTSC and TNF-α，respec?tively.圖4 CTSC和TNF-α的相關性散點圖

Zhang 等［24］的一項研究顯示，作為CTSC 的下游因子，TNF-α 表達量隨CTSC 的增加而增加，即CTSC和TNF-α/MAPK（p38）信號之間可能存在正反饋回路，CTSC 可通過該途徑增加肝癌細胞的增殖和遷移。TNF-α 是主要由單核巨噬細胞分泌的一種炎癥因子，可介導體內(nèi)的免疫及炎癥反應［25］，有研究顯示在動脈粥樣硬化中，TNF-α 表達上調(diào)，尤其在不穩(wěn)定性斑塊組表達上調(diào)更明顯［14-15］，本研究檢測粥樣硬化冠狀動脈TNF-α 水平，同樣顯示動脈粥樣硬化病灶內(nèi)TNF-α 水平高于對照組。另外，我們通過分析顯示CTSC 和TNF-α 之間存在顯著正相關關系，TNF-α能刺激炎癥因子的生成，直接發(fā)揮促炎作用［26］，其在動脈粥樣硬化病灶內(nèi)的高表達可能刺激炎癥細胞產(chǎn)生炎癥介質，導致壞死灶擴大，斑塊結構破壞等，從而影響斑塊的穩(wěn)定性，甚至導致急性心血管事件的發(fā)生。我們推測TNF-α 可能激活CTSC 表達，而CTSC 表達上調(diào)可通過激活蛋白激酶C/p38 MAPK/NF-κB 信號通路誘導促進巨噬細胞M1 極化［20］，增加炎癥因子的釋放，增強炎癥反應，導致冠心病動脈粥樣硬化的發(fā)生。

綜上所述，CTSC 和TNF-α 在粥樣硬化冠狀血管組織中的高表達提示CTSC 和TNF-α 兩者的協(xié)同作用可能促進粥樣硬化病灶內(nèi)的炎癥反應，并與粥樣硬化病灶的穩(wěn)定性下降有關。本研究直接檢測人體冠脈組織CTSC 和TNF-α 水平，彌補了動物實驗與人類種屬差異性的缺陷，但作為一項橫斷面研究，未探討其內(nèi)在作用機制，因此關于粥樣硬化病灶內(nèi)CTSC作用的病理生理機制有待下一步更深入的研究。