室旁核miR-9-5p通過靶向KCNN3介導T2D大鼠交感神經過度興奮*

徐佳琪，安美玲，袁 月，郝翊帆，王秀文，張 敏，未曉巍，2，李 華，王仁俊△

（吉林師范大學 1生命科學學院，2植物資源科學與綠色生產吉林省重點實驗室，吉林四平 136000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）能夠引發多種系統病變，造成極高的致殘率和致死率。截止到2013年，我國成人糖尿病患病率已經達到10.4%，預計到2045 年，全球18～99 歲的糖尿病患者將增長至6.93億［1-2］，可見，糖尿病的防控工作迫在眉睫。近年來，關于糖尿病的研究工作大多圍繞糖脂代謝通路展開，而在中樞調控機制方面的探索研究則十分匱乏。交感神經過度激活參與多種疾病的發生發展，加速了慢性心衰［3-5］和2 型糖尿病（type 2 diabetes melli?tus，T2D）［6-7］的惡化。據報道，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）［8］和神經型一氧化氮合酶（neuro?nal nitric oxide synthase，nNOS）［9］等介導糖尿病狀態下對室旁核（paraventricular nucleus，PVN）神經元興奮性的調節。糖尿病狀態下，大鼠PVN 神經元膜功能是否改變及引起膜功能發生變化的相關機制仍不明確。

細胞膜上的小電導鈣激活鉀通道（small-conduc?tance calcium-activated potassium channels，SK chan?nels）介導動作電位后超極化的發生，按不同亞基的結構和功能分為SK1～4共4種類型，相應的編碼基因為KCNN1（potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel，subfamily N，member 1）、KCNN2、KCNN3及KCNN4。研究發現，PVN 和視上核（supraoptic nucleus，SON）內SK3 高豐度表達［10］；PVN 內SK 通道參與調控大鼠交感神經活性［11-12］。目前未有研究報道PVN 內SK 通道是否參與糖尿病的發生發展。

近期研究顯示，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）參與T2D中胰島素信號轉導和血糖水平的調節等過程，T2D 患者外周血中多種miRNA 的表達水平隨疾病發展而改變［13］，但miRNA 是否參與T2D 的中樞發病機制還未見研究報道。本課題組利用Tar?getScan 生物信息學軟件預測miR-9-5p 與KCNN3 mRNA 的3′UTR 具有結合位點。miRNA 表達譜分析顯示大鼠PVN 內miR-9 表達頗豐［14］，且T2D 患者血漿miR-9 表達顯著上調［13］。然而，T2D 大鼠PVN 內miR-9是否同樣存在差異表達，進一步失衡的miR-9-5p 能否影響SK3 蛋白水平，并引發交感神經興奮亢進和血糖調節紊亂，仍不明確。故本實驗以T2D 大鼠為研究對象，觀察PVN 內miR-9-5p 和SK3 表達水平，并進一步闡明二者參與T2D 大鼠中樞交感神經活動的調控機制。

材料和方法

1 動物

Wistar 大鼠，雄性，180～220 g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，許可證號為SCXK（吉）2011-0004。置于恒溫（23±2）℃，12 h/12 h 明暗周期的環境中喂養。

2 儀器及試劑

miR-9-5p和KCNN3基因過表達和敲減腺相關病毒均由上海漢恒生物科技有限公司構建和包裝；血漿甘油三酯ELISA試劑盒（Abcam）；瘦素及去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）ELISA 試劑盒（IBL）；胰島素（insulin）ELISA 試劑盒（北京索萊寶）；Trizol 試劑盒（北京鼎國）。血糖儀（Invitrogen）；腦立體定位儀（Narishige，SR-5M-HT）等。

3 主要方法

3.1 構建T2D 大鼠模型 將大鼠隨機分為2 組，2型糖尿病模型（DM）組給予高脂飲食（high-fat diet，HFD），4周后腹腔注射低劑量（30 mg/kg）鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），誘導其產生高血糖癥狀，予以HFD 繼續飼養8 周；糖尿病對照（diabetes control，DC）組始終飼以正常飲食。喂養期間對大鼠體重及食物攝入量進行監測。

3.2 血漿葡萄糖和胰島素水平的檢測 對待測大鼠禁食12 h，將斷尾法獲取的血液置于含EDTA 的EP 管中，用血糖儀快速檢測大鼠空腹血糖濃度，空腹胰島素水平則按照ELISA 試劑盒說明進行測定。采血完畢進行糖耐量實驗，按2 g/kg體重給予大鼠口服葡萄糖，給藥2 h后按相同方法檢測上述兩種指標水平。計算胰島素抵抗指數：胰島素抵抗指數=空腹血糖×空腹血胰島素/22.5。

3.3 PVN 微量注射 STZ 注射8周后，通過腦立體定位儀將麻醉大鼠頭部固定，參照Paxinos&Watson大鼠腦圖譜定位下丘腦PVN（前囟向后1.8 mm，旁開0.5 mm，深7.2 mm），使用牙科鉆鉆開顱骨，將連接微量注射器的導管以1 mm/min 的速度插入PVN內，按每30 s 0.2 μL 的速度連續推注5 min，每側導管內共裝有2 μL 的rAAV2/9-hSyn-EGFP-miR-9-5p（1.5×1013vg/L），和/或rAAV2/9-hSyn-EGFP-sponge（miR-9-5p）（1.5×1013vg/L），或rAAV2/9-hSyn-EGFP-（NC miR-9-5p）（1.5×1013vg/L），或rAAV2/9-hSyn-EGFP-（NC sponge-miR-9-5p）（1.5×1013vg/L），和/或rAAV2/9-hSyn-EGFP-KCNN3 shRNA （siKCNN3）（1.5×1013vg/L），或 rAAV2/9-hSyn-EGFP-KCNN3 shRNA（NC siKCNN3）（1.5×1013vg/L），和/或2.5 μL的 rAAV2/9-hSyn-siKCNN3-P2A-EGFP （9×109vg/side），或rAAV2/9-hSyn-（NC siKCNN3）-P2A-EGFP（9×109vg/side），注射結束后留針10 min，避免病毒隨導管抽離流出，抽離速度同樣按1 mm/min進行，注射完畢封閉鉆孔，縫合皮膚，注射抗生素避免感染。需要對同1只大鼠PVN內注射2種重組腺相關病毒時，兩次輸注間隔2 h 進行。病毒注射4 周后檢測各干預組結果。

3.4 尿NE 排出量的測量 STZ 干預8 周后，將全部大鼠分別置于代謝籠內，24 h后收集排出的尿液，裝入含有礦物油的收集管中防止蒸發，尿液離心后，將上清液轉移到含有HCl 的離心管中，置于?80℃條件下儲存。使用NE ELISA 檢測試劑盒測定解凍后尿液內NE濃度。尿NE排出量=尿NE濃度×尿流量。

3.5 交感驅動指標的檢測 實驗前各組大鼠需禁食12 h，腹腔注射α-氯醛糖（70 mg/kg）和烏拉坦（0.75 g/kg）進行麻醉，仰臥位固定，分離出股動脈進行插管，連接壓力換能器，再將麻醉大鼠俯臥于手術臺上，固定后分離其腎交感神經，經多道生理記錄儀同步獲取大鼠標Ⅱ導聯心電圖、平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）和腎交感神經放電（renal sympathetic nerve discharge，RSND）活動。

3.6 血液采集及生化指標檢測 暴露麻醉大鼠心臟，于右心耳處剪一小口，迅速采集血液，將收集到的血液裝入離心管內，室溫靜置30 min 后，3 000 r/min 離心15 min，留取血清樣本，將樣本分裝并保存于?80℃條件下待測，避免反復凍融。血漿甘油三酯、NE 及瘦素水平均通過ELISA 法進行測定，操作流程嚴格遵照ELISA試劑盒說明書進行。

3.7 PVN 組織的提取 對含PVN 組織的連續6 張腦片進行取樣，每側PVN 打孔6 次，即每張切片取樣12次，得到PVN組織準備待測。

3.8 免疫熒光檢測目標蛋白的表達 取血完畢在大鼠心尖處入針，插入左心室，先后使用肝素鹽水（約250 mL）和4%多聚甲醛（約250 mL）對大鼠進行灌流，觀察大鼠尾部及四肢僵硬程度，判斷灌流是否成功。灌流完畢取出大腦，置于裝有4%多聚甲醛的15 mL 離心管內，4℃條件下固定4 h，然后將大腦依次轉移到含20%和30%的蔗糖溶液中梯度脫水，待沉降后取出，用吸水紙小心吸干大腦表面水分，經包埋劑包埋，置于?80℃冰箱冷凍。使用冰凍切片機切片，得到厚度為35 μm 的切片，收集含有PVN 組織的冠狀切片，確定PVN 區域及注射位點。將得到的腦切片在PBS 溶液中展開，挑取帶有PVN 組織的切片置于含PBS 的24 孔板中，洗片后轉移到含封閉液（PBS+10%羊血清）的EP 管內，37℃封閉1.5 h；沖洗切片，加入I抗，置于37℃培養箱孵育2 h；取出切片，沖洗后避光孵育熒光II 抗，此后操作均在暗環境下進行，同樣在37℃條件下孵育2 h。取出的腦片采用PBS 溶液清洗，沖洗3 次，每次5 min，沖洗后貼片，封片完畢用錫紙包裹，準備轉移至熒光顯微鏡下檢測目標蛋白的表達。

3.9 real-time PCR 檢 測miR-9-5p 和KCNN3 mRNA的表達水平 Trizol 法對待測組織內總RNA 進行抽提，逆轉錄得到cDNA，以U6 和GAPDH 分別作為miR-9-5p 和KCNN3 的內參照進行real-time PCR，引物序列見表1。檢測miR-9-5p 的擴增條件為：95℃預變性5 min；95℃變性12 s，62℃退火40 s，40 個循環。檢測KCNN3 mRNA 的擴增條件為：94℃預變性4 min；94℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環。

3.10 TargetScan 軟件預測KCNN3 mRNA 與miR-9-5p 的相互作用 通過TargetScan 生物信息學軟件預測可能影響KCNN3 mRNA 轉錄后翻譯的miRNA，分析KCNN3 mRNA與miR-9-5p是否具有靶標關系。

3.11 原代培養乳鼠下丘腦神經細胞和NG108 細胞 培養過程在無菌條件下進行，從新生Wistar 鼠（24 h 內）下丘腦分離出神經細胞，采用MEM 培養液進行體外原代培養。將NG108細胞接種到含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基中，培養基內補充有HAT（hypoxanthine-aminopterin-thymidine；1%）、鏈霉素（100 mg/L）及青霉素（1×105U/L），接種后置于含5% CO2的培養箱中，保證箱內氣體環境濕潤，在37℃條件下培養。當細胞融合率大于85%時加入胰酶傳代。

表1 用于real-time PCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers used for real-time PCR

3.12 細胞轉染miR-9-5p 將待轉染的原代神經細胞和NG108 細胞分別置于6 孔板培養，并隨機分組，包括空白對照組、miR-9-5p 轉染組、miR-9-5p+antimiR-9-5p轉染組和NC miR-9-5p陰性對照組，在細胞融合率達70%時，使用agomiR-9-5p（50 nmol），和/或antagomiR-9-5p（100 nmol），或NC agomiR-9-5p（50 nmol）對NG108 細胞進行轉染，繼續培養72 h 后，檢測各轉染組SK3蛋白的表達水平。

3.13 Western blot 檢測SK3 的蛋白水平 將蛋白提取緩沖液分別與PVN 組織、原代神經細胞和NG108細胞混合，超聲破碎后置于離心機內，離心8 min（4℃、12 000 r/min），取上清。BCA 法確定總蛋白濃度。調整合適蛋白濃度，加入等量的2×4%SDS樣品緩沖液。將蛋白樣本注入SDS-PAGE 凝膠中進行電泳。電泳結束后，獲取膠板上的目的蛋白，采用“三明治法”將其轉移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉，4℃過夜。加入I抗4℃孵育過夜，經TBS洗滌3次，每次10 min 后，于暗室中使用熒光素標記的Ⅱ抗進行孵育，1 h 后洗膜TBS 洗滌（3 次，每次10 min），最后對膜進行掃描拍照和分析。蛋白表達量通過目標蛋白強度與GAPDH強度的比值來計算、統計及分析。

3.14 雙螢光素酶報告基因實驗 用real-time PCR擴增miR-9-5p 與KCNN3 序列上的結合片段，將該片段插入到pMIR-REPORT 螢光素酶載體中，構建KCNN3 野生質粒；用KCNN3 野生質粒，分別與agomiR-9-5p，和/或antagomiR-9-5p，或NC agomiR-9-5p 共轉染HEK293 細胞。48 h 后，根據Dual-Luci?ferase?報告基因試劑盒說明書檢測各組螢光素酶活性，驗證miR-9-5p與KCNN3 mRNA的靶向關系。

4 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統計分析。數據以均數±標準誤（mean±SEM）的形式表示。兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05表明差異有統計學意義。

結 果

1 T2D大鼠模型的鑒定

將HFD 聯合STZ 誘導12 周的DM 組大鼠生理指標與DC組大鼠進行比較。與DC組相比，DM 大鼠的體重、腹膜后脂肪墊和腎臟重量均顯著增加（P＜0.05）；棕色脂肪組織含量明顯降低（P＜0.05）。DM大鼠血漿甘油三酯、瘦素及空腹血糖水平明顯上調（P＜0.05），并出現糖耐量異常，DM 大鼠胰島素敏感性指數有所降低，但差異無統計學顯著性（P＞0.05）。DM 大鼠的RSND 和尿NE 水平顯著增加（P＜0.05），見表2。以上結果表明DM 大鼠表現出高血糖、高血脂癥、胰島素抵抗和交感神經活動亢進狀態，證明T2D模型構建成功。

2 TargetScan 軟件預測miR-9-5p 與KCNN3 存在靶向調節關系

TargetScan 軟件預測KCNN3 mRNA 的3′UTR 上存在兩段miR-9-5p 的靶序列，具有多個堿基互補位點，表明miR-9-5p 可能參與調控KCNN3 mRNA 的轉錄后翻譯，且在人類、大鼠和小鼠間高度保守，見表3。

3 Real-time PCR結果

與DC 組相比，DM 大鼠PVN 內miR-9-5p 的表達水平顯著上調（P＜0.05），見圖1A，而KCNN3 mRNA水平的差異無統計學顯著性（P＞0.05），見圖1B。

4 PVN 內微量注射miR-9-5p、anti-miR-9-5p、NC miR-9-5p 和NC anti-miR-9-5p 對2 型糖尿病大鼠交感驅動指標和空腹血糖的影響

微量注射rAAV-miR-9-5p 至DC 和DM 大鼠PVN內，導致RSND、NE 及血糖水平明顯增加（P＜0.05）；微量注射anti-miR-9-5p 則得到完全相反的結果，使交感活動受到抑制，下調NE 及血糖水平（P＜0.05），見圖2。與DC 組相比，DM 組大鼠對病毒干預的反應更為強烈，呈現出增敏狀態，提示miR-9-5p水平升高可能參與T2D發病過程。

5 PVN 內微量注射KCNN3、siKCNN3、NC KCNN3和NC siKCNN3 對2 型糖尿病大鼠交感驅動指標和空腹血糖的影響

微注射rAAV-KCNN3 至DC 和DM 大鼠PVN 內，可以顯著抑制交感活動、降低大鼠血糖水平（P＜0.05）；rAAV 敲減PVN 內KCNN3則會引起交感激活及血糖增高（P＜0.05），見圖3。與DC組相比，DM 大鼠對微量注射的反應更為敏感，提示KCNN3 水平上調有助于改善T2D的血糖和交感神經興奮狀態。

表2 DM組與DC組大鼠解剖學和交感驅動生理學指標的檢測結果Table 2.The indexes of anatomy and sympathetic drive in the DM and DC rats（Mean±SEM）

表3 miR-9-5p與KCNN3 mRNA 3′UTR的互補序列Table 3.The complementary sequences between miR-9-5p and the 3′UTR of KCNN3 mRNA

Figure 1.Up-regulated miR-9-5p inhibited KCNN3 expression in PVN of the rats with T2D.A：relative expression of miR-9-5p in PVN of DC and DM rats；B：the mRNA expression of KCNN3 in PVN of DC and DM rats；C：the protein expression of SK3 in PVN and SON of DC and DM rats；D：verification of interaction between miR-9-5p and the 3′-UTR of rat KCNN3 gene in HEK293 cells was determined by luciferase reporter assay.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs DC group；?P＜0.05 vs null group.圖1 T2D大鼠PVN中上調的miR-9-5p抑制KCNN3表達

6 免疫熒光檢測FosB和SK3陽性神經元的數量

微量注射miR-9-5p 至DC 組和DM 組大鼠PVN內，導致FosB 陽性神經元數量顯著增加（P＜0.05），見圖4A、C；SK3 陽性神經元數量明顯減少（P＜0.05），見圖4B、D；與DC組相比，miR-9-5p干預誘發DM 大鼠PVN 內FosB 和SK3 陽性神經元數量變化的幅度更大，見圖4。

7 Western blot檢測SK3蛋白的表達水平

與DC 組相比，DM 組大鼠PVN 內SK3 蛋白的表達量顯著下調（P＜0.05），然而SON 內未見SK3 的差異表達（P＞0.05），見圖1C。細胞轉染實驗結果表明，轉染miR-9-5p 至原代神經細胞或NG108 細胞均能夠顯著抑制細胞內SK3 蛋白的表達（P＜0.05）；加入anti-miR-9-5p 后能夠有效解除miR-9-5p 對KCNN3 mRNA 表達的阻遏，提升SK3 蛋白水平，NC miR-9-5p 孵育對SK3 蛋白表達無顯著影響（P＞0.05），見圖5。

8 螢光素酶報告基因實驗驗證miR-9-5p 和KCNN3的靶向關系

miR-9-5p 顯著降低KCNN3 mRNA 3′UTR 的螢光素酶活性（P＜0.05），見圖1D。結果顯示miR-9-5p靶向調控KCNN3的mRNA表達。

9 注射位點的鑒定

本文僅展示DM 和DC 大鼠PVN 注射miR-9-5p及KCNN3 mRNA 的位點鑒定結果。切片的組織學數據顯示，切片內共有56 次注射，其中48 次注射到PVN 內，8 次偏離PVN，見圖6。注射偏離所得實驗結果作為解剖學陰性對照。

討 論

本研究在體實驗研究發現，T2D 大鼠PVN 內miR-9-5p 的表達顯著上調、SK3 蛋白表達水平顯著下調；PVN 內過表達miR-9-5p 明顯下調SK3 的蛋白水平、增加FosB 陽性神經元數量，引起交感神經興奮性亢進，升高血糖水平；PVN 過表達KCNN3 或轉染anti-miR-9-5p 均能有效抑制交感興奮并降低血糖水平，DM 組對干預的反應強于DC 組。本研究離體實驗研究發現：在原代腦神經細胞或NG108 細胞轉染miR-9-5p 可顯著抑制SK3 蛋白的表達，轉染antimiR-9-5p 可有效降低miR-9-5p 對SK3 蛋白表達的抑制作用。結果提示miR-9-5p 很可能通過抑制KCNN3 mRNA 的轉錄后翻譯，進一步下調PVN 內SK3 蛋白水平，最終導致T2D 大鼠交感神經過度激活和血糖水平升高。本研究為糖尿病的防治工作提供了新的靶點和新策略。

Figure 2.The effects of microinjection of miR-9-5p，anti-miR-9-5p，NC miR-9-5p and NC anti-miR-9-5p in PVN of rats with T2D on the sympathetic drive indexes and fasting plasma glucose.A：mean arterial pressure（MAP）；B：heart rate（HR）；C：re?nal sympathetic nerve diacharge（RSND）；D：plasma norepinephrine（NE）；E：original tracings of MAP and RSND；F：fasting plasma glucose.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs null group；?P＜0.05 vs miR-9-5p group；?P＜0.05 vs miR-9-5p+antimiR-9-5p group；#P＜0.05 vs DC+null group.圖2 PVN 內微量注射miR-9-5p、anti-miR-9-5p、NC miR-9-5p 和NC anti-miR-9-5p 對2 型糖尿病大鼠交感驅動指標和空腹血糖的影響

Figure 3.The effects of microinjection of KCNN3，siKCNN3，NC KCNN3 and NC siKCNN3 in PVN in rats with T2D on the sympathetic drive indexes and fasting plasma glucose.A：mean arterial pressure（MAP）；B：heart rate（HR）；C：renal sympathetic nerve diacharge（RSND）；D：plasma norepinephrine（NE）；E：original tracings of MAP and RSND；F：fasting plasma glucose.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs null group；?P＜0.05 vs KCNN3 group；?P＜0.05 vs KCNN3+siKCNN3 group；#P＜0.05 vs DC+null group.圖3 PVN內微量注射KCNN3、siKCNN3、NC KCNN3和NC siKCNN3對2型糖尿病大鼠交感驅動指標和空腹血糖的影響

Figure 4.Effects of microinjection of miR-9-5p，anti-miR-9-5p，NC miR-9-5p and NC anti-miR-9-5p on the number of FosB and SK3 positive cells in PVN in rats with T2D.A：the number of FosB positive cells in the PVN；B：the number of SK3 posi?tive cells in the PVN；C：the immunofluorescence photomicrographs from the sections of the PVN region stained for FosB in DC and DM rats；D：the immunofluorescence photomicrographs from the sections of the PVN region stained for SK3 in DC and DM rats.The scale bar=50 μm.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs null group；?P＜0.05 vs miR-9-5p group；?P＜0.05 vs miR-9-5p+anti-miR-9-5p group；#P＜0.05 vs DC+null group.圖4 微量注射miR-9-5p、anti-miR-9-5p、NC miR-9-5p和NC anti-miR-9-5p對2型糖尿病大鼠PVN 內FosB 及SK3陽性神經元數量的影響

近年來，大量研究發現機體內miRNA 水平的改變是影響糖尿病發生發展的重要因素［15］。然而，就中樞miRNA 參與心血管疾病自主神經調控的相關探索十分匱乏，即心衰大鼠PVN 內miR-133a 下調會使血管緊張素原和血管緊張素II 型1 型受體表達增加，引起交感興奮［16］；我們前期研究發現慢性心衰大鼠PVN 內miR-7b 抑制PVN 內GABBR1 表達，從而促使交感過度激活［17］。值得注意的是，近期有研究表明T2D患者外周血漿miR-9水平升高，本研究觀察到的PVN內升高的miR-9-5p是內源性的還是由外周血穿過血腦屏障引起的還未可知。由此，升高的miR-9-5p 的來源還有待進一步研究。另外，本實驗模型表現出高血脂癥、β細胞功能損害及胰島素抵抗等特征，將來可以將檢測miR-9-5p 水平對幾種特征的直接影響作為研究目的，探索miR-9-5p 水平失衡與T2D發病機制間的更多關聯。

Figure 5.The effect of miR-9-5p，anti-miR-9-5p and NC miR-9-5p on the protein expression of SK3 in primarily cultured neonatal rat hypothalamus neurons and NG108 cells.A：the protein expression of SK3 in the primarily cultured neonatal rat hypothala?mus neurons；B：the protein expression of SK3 in the NG108 cells.Mean±SEM. n=6. *P＜0.05 vs null group；?P＜0.05 vs miR-9-5p group.圖5 miR-9-5p轉染對原代培養新生大鼠下丘腦神經細胞和NG108細胞內SK3蛋白表達量的影響

Figure 6.Schematic drawings of rat hypothalamus PVN in coronal section.The distance（in mm）posterior to bregma is shown for each section.“●”represent the sites of termination of an injection that is within the PVN region in DC group；“+”repre?sent that in DM group.3V：the third cerebral ventricle；AHP：anterior hypothalamic area，posterior part；AHC：anterior hypothalamic area，central part.圖6 大鼠下丘腦PVN微量注射位點鑒定示意圖

交感神經興奮亢進是T2D 患者的一項重要病理特征，PVN 是下丘腦內控制交感傳出的關鍵核團，免疫熒光檢測結果顯示，DM 組大鼠PVN 內FosB 陽性神經元數量較DC 組明顯增加，表明中樞神經被慢性激活［18］。微量注射miR-9-5p到PVN顯著上調兩組大鼠的FosB 水平，引起血漿NE 和RSND 升高，提示miR-9-5p 過表達可促進中樞交感神經系統慢性激活。SK 通道作為調控交感神經活動的重要功能蛋白在PVN 和SON 內高度表達，本研究結果顯示DM大鼠PVN 內SK3 水平顯著低于DC 組，提示PVN 內SK3 表達下調可能在T2D 大鼠交感激活中發揮作用。在體實驗和離體實驗均表明過表達或敲減miR-9-5p分別降低或增加SK3 蛋白水平，同時改變大鼠交感神經興奮狀態，證實PVN 內miR-9-5p 與糖尿病的發生發展關系密切。另有研究表明，部分miRNA在T2D 和運動訓練后的表達圖譜相反，例如具有抗炎作用的miR-192 和miR-24 等［13］，表明運動的抗炎特性可能對T2D 患者有益，而運動訓練是否能夠調節miR-9-5p 水平，能否對miR-9-5p 的中樞作用產生影響，這將是我們后續的研究課題。

綜上所述，我們的研究發現HFD 聯合STZ 誘導T2D 大鼠PVN 內miR-9-5p 和SK3 蛋白表達失衡可誘發交感神經過度激活和血糖水平升高，這種作用可能與miR-9-5p 通過抑制KCNN3 mRNA 的轉錄后翻譯，進一步下調PVN 內SK3 蛋白水平有關。本研究為糖尿病的防控和治療提供了全新的干預靶點、途徑和策略。