達沙替尼通過上調p53表達和下調AKT磷酸化抑制腎癌細胞系786-O及769-P體外活力與遷移*

謝開紅，梁家健，蔡大霞，安姿旖，劉革修，胡小毛△

（1湘南學院附屬醫院腫瘤科，湖南郴州 423000；2暨南大學醫學院血液病研究所，廣東廣州 510632）

腎癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤，以來源于腎小管上皮的透明細胞癌占絕大多數，治療效果差，是導致患者死亡的主要類型［1］。針對其VHL抑癌基因失活導致的低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板衍生生長因子（platelet-de?rived growth factor，PDGF）過表達的特性，目前腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）的治療采用了靶向VEGF 信號軸的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），包括索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、阿昔替尼、樂伐替尼和卡博替尼［2］。但是在這些藥物的臨床應用中觀察到原發性和獲得性耐藥情況，所以需要尋找新的替代藥物。達沙替尼（dasatinib）是最早被使用的一種TKI，主要用于慢性髓系白血病的治療。后來在一些實體瘤臨床試驗中觀察到達沙替尼也有一定的效果，包括腦膠質瘤、肺癌、卵巢癌和前列腺癌等［3］。相較于目前臨床使用的其他酪氨酸激酶抑制劑，達沙替尼抑制的激酶種類更為多樣，包括SRC、SFKs、BCR-ABL、c-KIT、PDGFR、c-FMS 和EPHA2。在上述實體瘤中已經證實，達沙替尼除了抗血管生成外，還可抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移過程［4］。因此，達沙替尼可能是治療腎癌的一種新的可替代藥物。本項工作探討達沙替尼體外對人腎透明細胞癌細胞株786-O 及769-P 活力、凋亡及遷移的影響，為達沙替尼治療腎癌提供參考資料。

材料和方法

1 細胞

人腎癌細胞株786-O 及769-P 購自中國科學院上海細胞庫，于含1%青霉素-鏈霉素雙抗及10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中培養。

2 主要試劑

以二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；購于MP Biomedicals）為溶劑，制成20 mmol/L 的達沙替尼（購于APExBIO）用于體外實驗。RPMI-1640 完全培養液（HyClone）；胎牛血清（Gibco）；MTT 試劑盒（Dojindo）；細胞周期試劑盒（南京凱基公司）；Hoechst 33258 染色液（Solar）；RIPA 細胞裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；ECL化學發光試劑盒（Thermo）；兔抗人cleaved caspased-3（cl-caspase-3）單抗、兔抗人cleaved caspased-9（cl-caspase-9）單抗、兔抗人p-AKT 單抗、鼠抗人細胞周期蛋白D1（cyclin D1）單抗、鼠抗人p21 單抗、鼠抗人p53 單抗、鼠抗人GAPDH 單抗以及辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG（Cell Signaling Technology）。

3 主要儀器

DNM-9602G自動酶標儀購自北京普朗新技術有限公司；FACSCalibur 流式細胞儀購自BD；Heal?ForeNeofuge13臺式高速冷凍離心機購自上海力申科學儀器有限公司；PAC1000 型蛋白電泳及轉印系統購自Bio-Rad；Meta-Morph 凝膠成像分析系統購自Media Cybernetics。

4 主要方法

4.1 MTT 法檢測細胞活力 將對數期的786-O 細胞及769-P 細胞分別接種于96 孔板中（每孔3 000個），每孔100 μL，復孔3 個。在CO2培養箱中于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液里培養12 h 后加入達沙替尼，依據達沙替尼體外作用腫瘤細胞系的報道［5］，以及前期預實驗確定實驗濃度，使其終濃度分別為0 μmol/L、0.015 6 μmol/L、0.031 3 μmol/L、0.062 5 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L 和2 μmol/L，同時設置調零孔（RPMI-1640 培養液+0.1%DMSO）和空白對照孔（細胞、0.1%DMSO和RPMI-1640培養液）。在含5%CO2和飽和濕度的37℃培養箱中繼續培養24 h 后，每孔加MTT 溶液（5 g/L，用PBS 配制，pH=7.4）10 μL，繼續孵育4 h，終止培養，吸棄孔內培養上清液后每孔加100 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解，選擇570 nm波長在酶聯免疫監測儀上測定各孔吸光度（A）值。將獨立重復3 次的數據導入GraphPad Prism 8.2.1 作折線圖［6］。對后面涉及的細胞周期和凋亡相關實驗，以生長曲線中達沙替尼最低有效濃度以及IC50為參照設置藥物濃度（0.5 和1 μmol/L）。細胞遷移實驗中，為降低達沙替尼對細胞活力的抑制作用，采用較低濃度（0～0.031 3 μmol/L）進行實驗。

4.2 劃痕實驗檢測達沙替尼對細胞遷移能力的影響 將對數期的786-O及769-P細胞分別接種于6孔板中（每孔50 000 個），待細胞在血清含量為10%的RPMI-1640 培養液中貼壁并長至融合時，使用200 μL 吸頭在6 孔板中間均勻地劃1 條直線后用PBS 輕洗去漂懸的細胞，加入達沙替尼和含2%胎牛血清的RPMI-1640 培養液，使達沙替尼終濃度分別為0 μmol/L、0.007 8 μmol/L、0.015 6 μmol/L 和0.031 3 μmol/L，分別在加藥后0、6、12 和24 h 時在倒置顯微鏡（Leica）下觀察拍照，然后使用Image-Pro Plus 軟件分析照片，測量劃痕位置的面積和高度，將面積除以高度可以得到平均的劃痕寬度，將0 h的劃痕寬度減去實驗結束時的劃痕的寬度，得到的就是細胞遷移的距離，以細胞遷移距離計算細胞遷移能力。將3次獨立重復的數據分析后進行統計分析并繪制柱狀圖［6］。

4.3 PI 單染法檢測達沙替尼對細胞周期的影響將對數期的786-O 及的769-P 細胞分別以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液置于25T培養瓶中培養，當細胞長至60%～70%融合時加入達沙替尼，使其終濃度分別為0、0.02、0.1 和0.5 μmol/L；在含5% CO2且飽和濕度的37℃細胞培養箱中培養24 h 后，200×g離心5 min收集所有的細胞，PBS重懸后離心（200×g，5 min）去上清，加入600 μL PBS 重懸細胞后逐滴加入1 400 μL無水乙醇，?20℃固定過夜后離心去上清（200×g，5 min），PBS 重懸后離心（200×g，5 min）、加入RNase（工作濃度20 mg/L），37℃孵育30 min 后離心去上清（200×g，5 min），加入PI（工作濃度50 mg/L），室溫避光孵育30 min，最后過300目篩后上流式細胞儀（ACEA）檢測［6］。

4.4 Hoechst 33258 染色檢測達沙替尼對細胞凋亡的影響 將對數期的786-O 及769-P 細胞分別接種6孔板中（每孔50 000 個），在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液中培養，當細胞長至60%～70%融合時加入達沙替尼，終濃度分別為0 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L 和2 μmol/L；在含5% CO2且飽和濕度的37℃細胞培養箱中培養24 h 后，離心收集所有細胞，加入0.5 mL 固定液懸起細胞后室溫固定10 min，離心去固定液，用PBS 洗2遍，每次3 min。離心后吸去大部分液體保留50 μL液體，輕輕混勻細胞后滴加至載玻片上。均勻滴上0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min。用PBS 洗2 遍，每次3 min，滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上蓋玻片。接著于熒光顯微鏡中的DAPI 通道中觀察拍照，正常細胞，胞核呈光滑圓形，胞核染色較均一；凋亡細胞，胞核碎片化，因DNA 濃縮致密而深染（藍色發白）；壞死細胞，胞核邊緣不清晰，DNA 不濃縮；正在分裂的細胞，因DNA 濃縮致密而深染，但顯著可見兩組DNA 分列兩排。計數總細胞數和凋亡細胞數，計算兩者比例，將3 次獨立重復的數據都分析完后進行統計分析并繪制柱狀圖［6］。

4.5 Western blot 檢測細胞周期及細胞凋亡相關蛋白水平 對數期786-O 及769-P 細胞以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液置于25T培養瓶中培養，當細胞長至60%～70%融合時加入達沙替尼，終濃度為0 μmol/L、0.5 μmol/L 和1 μmol/L。在5%CO2且飽和濕度的37℃、細胞培養箱中培養24 h 后收集所有的細胞，冰上RIPA 裂解液裂解細胞提取總蛋白后，BCA 法測定蛋白濃度，接著以每孔上樣40 μg蛋白量進行蛋白電泳（恒壓，先70 mV 持續30 min，后110 mV 持續90 min），待蛋白跑至分離膠底層后以濕轉法（恒流220 mA，持續2 h）轉到PVDF 膜上，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，TBS 洗膜5 min，4℃孵Ⅰ抗12 h，TBS 洗膜（3 次，每次10 min）室溫下振蕩孵Ⅱ抗1 h，TBS 洗膜（3 次，每次10 min），最后條帶ECL 化學發光后在全自動化學發光和熒光凝膠成像系統（UVITEC）中顯影拍照，并用Gel-Pro Analyzer 6.0 軟件對照片進行分析，將目的蛋白的灰度值除以內參蛋白的灰度值，進行歸一化處理［6］。

5 統計學處理

實驗數據應用GraphPad Prism 8.2.1 進行統計分析和作圖，結果以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，在各組間差異有統計學意義的基礎上再進行兩兩比較的t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 達沙替尼抑制786-O及769-P細胞活力

用梯度濃度的達沙替尼處理24 h 后，786-O 及769-P的細胞活力出現不同程度的抑制（圖1）。隨著達沙替尼濃度的增大（0.015 6～2 μmol/L），786-O 及769-P 細胞活力逐漸降低，其中達沙替尼對786-O 及769-P 細胞株的IC50分別為（0.9587±0.0288）μmol/L和（0.7843±0.0660）μmol/L。

Figure 1.Dasatinib inhibited the viability of 786-O and 769-P cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.圖1 達沙替尼對786-O及769-P細胞活力的抑制作用

2 達沙替尼抑制786-O及769-P細胞遷移

786-O 及769-P 細胞進行劃痕實驗，觀察達沙替尼對細胞遷移能力的影響。0 μmol/L 的dasatinib 組24 h 時細胞已基本融合，實驗組細胞則有不同程度的空白區，表明達沙替尼對786-O 及769-P 細胞的遷移有抑制作用（P＜0.05），并隨著達沙替尼濃度的增加，抑制遷移的作用越顯著，呈濃度依賴性（P＜0.05或P＜0.01），見圖2、3。

Figure 2.Dasatinib blocked the migration ability of 786-O cells.The migration ability of 786-O cells was detected by wound healing method（scale bar=300 μm）.The distance of migratory cells was normalized to the value of 0 h group.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 0.0078 μmol/L group；△P＜0.05 vs 0.0156 μmol/L group.圖2 達沙替尼阻滯786-O細胞遷移

Figure 3.Dasatinib blocked the migration ability of 769-P cells.The migration ability of 769-P cells was detected by wound healing method（scale bar=300 μm）.The distance of migratory cells was normalized to the value of 0 h group.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 0.0078 μmol/L group；△P＜0.05 vs 0.0156 μmol/L group.圖3 達沙替尼阻滯769-P細胞遷移

3 達沙替尼阻滯786-O及769-P細胞周期

達沙替尼處理24 h 后，與0 μmol/L dasatinib 組相比，各實驗組處于G1期的細胞比例均有增加（P＜0.05），且隨著達沙替尼濃度的增加，G1期的細胞比例也增加（P＜0.05），相應的S期的細胞比例減小（P＜0.05）；兩細胞系的G2期細胞變化略有差異，處于G2期的786-O 細胞比例無顯著變化（P＞0.05），而處于G2期的769-P 細胞比例總體減小（P＜0.05），見圖4、5。

Figure 4.Dasatinib induced cell cycle arrest of 786-O cells.Propidium iodide（PI）staining method was used to detected the cell cy?cle（A）and the data was showed with a statistical histogram（B）.D0：0 μmol/L dasatinib；D0.02：0.02 μmol/L da?satinib；D0.1：0.1 μmol/L dasatinib；D0.5：0.5 μmol/L dasatinib.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 0.02 μmol/L group.圖4 達沙替尼誘導786-O細胞周期阻滯

Figure 5.Dasatinib induced cell cycle arrest of 769-P cells.Propidium iodide（PI）staining method was used to detected the cell cy?cle（A）and the data was showed with a statistical histogram（B）.D0：0 μmol/L dasatinib；D0.02：0.02 μmol/L da?satinib；D0.1：0.1 μmol/L dasatinib；D0.5：0.5 μmol/L dasatinib.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 0.02 μmol/L group.圖5 達沙替尼誘導769-P細胞周期阻滯

4 達沙替尼促進786-O及769-P凋亡

達沙替尼處理24 h后，進行Hoechst 33258染色，從圖6A 可以看出對照組絕大部分細胞胞核呈光滑圓形，胞核染色較均一，為正常細胞；各實驗組可見不同比例的凋亡細胞，即胞核碎片化，因DNA 濃縮致密而深染（藍色發白），并隨著達沙替尼濃度的增大，凋亡細胞的比例逐漸增大（P＜0.01），見圖6B。

5 達沙替尼對786-O 及769-P 細胞周期和凋亡相關蛋白的影響

達沙替尼處理24 h 后，各實驗組凋亡相關蛋白cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 的蛋白表達量相對于對照組顯著增加（P＜0.01）；同時，cyclin D1的表達量均較對照組下降（P＜0.01），周期相關通路蛋白p53和p21表達量均較對照組增加（P＜0.01），p-AKT水平則較對照組減少（P＜0.01），見圖7、8。

Figure 6.Dasatinib promoted the apoptosis of 786-O cells and 769-P cells in vitro.Hoechst 33258 staining was used to detected the apoptosis（A，scale bar=100 μm）and the data was showed with a statistical histogram（B）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；##P＜0.01 vs 0.5 μmol/L group；△△P＜0.01 vs 1 μmol/L group.圖6 達沙替尼在體外促進786-O和769-P細胞凋亡

討 論

本研究結果顯示達沙替尼在一定范圍內呈濃度依賴性地抑制腎癌細胞株786-O 和769-P 的活力與遷移，并誘導凋亡，該結果提示了達沙替尼在治療腎癌方面存在深入研究意義。本研究進一步分析顯示，達沙替尼作用于腎癌細胞株786-O 和769-P 的機制與降低AKT 的磷酸化水平、上調cleaved caspase-3和cleaved caspase-9 蛋白水平有關。已有研究資料顯示，在腎細胞癌中存在突變的VHL以及異常活化的VEGF 和PDGF 等，它們則導致細胞生長與存活關聯蛋白AKT 活性異常增加，促進瘤細胞發生發展［7］。而且RCC 中VHL-HIF 和PI3K-AKT 信號通路緊密相連：VHL缺失而引起的HIF上調促進了多種生長因子的表達，包括EGF，PDGF 和VEGF［8］，這些因子則通過受體酪氨酸激酶途徑激活PI3K/AKT 信號，再激活mTORC1 和mTORC2 會促進HIF 表達［9］，形成正反饋回路，促進RCC 的發生發展。本研究結果不僅與上述研究資料相呼應，而且也進一步印證了達沙替尼的藥理作用，如研究報道其通過抑制SRC 影響PI3KAKT 和Ras-MAPK 途徑，誘導鼻咽癌細胞凋亡［10］。已有資料報道，PI3K 信號通路抑制劑對于PI3K-AKT通路被高度激活的RCC 顯示出有益的臨床效果［11］。所以，本研究結果提示達沙替尼可通過抑制PI3KAKT信號通路發揮抗腎癌細胞潛力。

由于達沙替尼是多種激酶的TKI 藥物，本研究也探討了其它作用途徑。p53 功能的喪失是腎細胞癌發展的關鍵事件，與細胞周期和腫瘤細胞轉移相關［12］。本研究結果檢測到達沙替尼可使腎癌細胞胞內p53 和p21 表達量增加，進而下調cyclin D1 的表達，使腎癌細胞周期阻滯于G1期，抑制腎癌細胞增殖，該結果證實了其可以通過p53 途徑影響細胞周期、抑制細胞生長，說明其藥理作用的多樣性，同時提示其某些特殊情況的應用前景。已有臨床研究表明，達沙替尼在體內可降低腎癌患者血清VEGF 的水平，說明其具有抑制癌內血管生長作用［13］。此外，在犬模型的研究中顯示，達沙替尼通過抑制c-SRC并增強Wnt 和HER 信號轉導，從而阻滯乳癌細胞的遷移和轉移［14］。本研究體外實驗結果也證實達沙替尼可阻滯786-O 和769-P 細胞的遷移，提示達沙替尼抑制腎癌細胞轉移的可能性。

Figure 7.The effect of dasatinib on the levels of cell cycle-related（A）and apoptosis-related（B）proteins in 786-O cells.The electro?phoresis strips′ gray scale values were showed with a histogram（C）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；##P＜0.01 vs 0.5 μmol/L group.圖7 達沙替尼對786-O細胞周期和凋亡相關蛋白表達的影響

Figure 8.The effect of dasatinib on the levels of cell cycle-related（A）and apoptosis-related（B）proteins in 769-P cells.The electro?phoresis strips′ gray scale values were showed with a histogram（C）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；##P＜0.01 vs 0.5 μmol/L group.圖8 達沙替尼對769-P細胞周期和凋亡相關蛋白表達的影響

達沙替尼最初用于血液髓系腫瘤的治療，目前逐步用于部分實體瘤的治療［15］。本研究則在體外細胞水平觀察了達沙替尼抑制腎癌細胞活力與遷移，提示了其治療腎癌應用的可能性。但是需要進一步的體內實驗和臨床試驗才能驗證其治療腎癌的有效性和可行性。