淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方介導鐵調素干預AD細胞模型ADAM10表達的研究*

馬冬雪，高維娟，劉真一，張紅軍，王嘉穎，董賢慧△

（1河北中醫學院，河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，河北石家莊 050091；2承德醫學院病理生理學教研室，河北承德 067000）

腦部出現老年斑是阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）的主要病理學標志［1］，其核心成分是β-淀粉樣蛋白（amyloid-β peptide，Aβ）［2］，Aβ 是淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）水解代謝產生的［3］。去整合素金屬蛋白酶10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）被認為是APP 的非淀粉樣剪切中重要的分泌酶［4］，ADAM10的表達變化影響著AD的發生發展。

AD 患者的腦鐵水平異常升高［5-6］，異常增高的腦鐵啟動機體級聯放大機制，最終導致神經元死亡［7］。降低增高的腦鐵是防治AD 的一個有效方法。鐵調素（hepcidin，HAMP）是近年來發現的鐵調節激素，但HAMP 是否通過調節AD 患者腦鐵代謝干預APP淀粉樣代謝通路，目前尚未見報道。

中醫認為AD 發病是以腎虛精虧、氣血不足為本，痰瘀互結、濁毒內生為標的本虛標實之證。根據中醫“標本兼治”的治療原則，治療AD 應補腎健脾，益氣養血以培其本，化痰、祛瘀、解毒以治其標。本課題組前期研究顯示，應用淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方可以有效上調AD 模型小鼠HAMP 的表達［8］，緩解小鼠腦組織鐵超載，下調AD 小鼠模型Aβ的表達和減少SP 的沉積［9］，但其具體機制仍然不明確。因此，本課題組以Aβ25-35誘導HT22細胞為AD細胞模型，采用免疫熒光、qPCR 和Western blot 方法檢測淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方介導HAMP 對小鼠海馬神經元細胞系HT22 細胞APP 水解中關鍵酶ADAM10 表達的影響，為揭示淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方防治AD的內在機制提供參考資料。

材料和方法

1 細胞株

小鼠海馬神經元細胞系HT22 由河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室提供。

2 藥品、試劑及儀器

黃芪甲苷、淫羊藿苷和葛根素由南京澤朗醫藥科技有限公司提供。DMEM 高糖培養液購自Gibco；Triton X-100 購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；ADAM10抗體購自Abcam；OPTI-MEM Amyloid Precursor?I（1×）購自Gibco；Lipofectamine?3000 購自Invitro?gen；Aβ25-35購自Sigma；CCK-8 試劑盒購自莊盟國際生物基因科技有限公司。

3 方法

3.1 HT22 細胞的培養、分組及處理 HT22 細胞復蘇后，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 完全培養液放入細胞培養瓶中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱，待細胞融合至80%～90%時即可傳代。取形態良好、對數生長期的HT22 細胞用于后續實驗。

Aβ25-35配制方法：將1 mg Aβ25-35溶于943 μL 三蒸水，配成1 000 μmol/L 母液，置于37℃培養箱孵育7 d，使之老化，分裝，于-20℃凍存。用Aβ 的活性片段Aβ25-35誘導HT22細胞建立AD細胞模型。

確定淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方作用濃度和沉默效果后，將HT22 細胞以每孔2×105個的密度接種于6 孔板，培養12 h 待細胞貼壁后隨機分為7組：正常對照組（不添加任何藥物的等體積的完全培養液）、Aβ 組（加入Aβ25-35處理HT22 細胞24 h 建立AD 細胞模型）、RNAi 組（HT22 細胞轉染HAMPsiRNA-3）、Aβ+RNAi 組（加入Aβ25-35處理HT22 細胞24 h 后轉染HAMP-siRNA-3）、Aβ+TCM 組（加入Aβ25-35處理HT22細胞24 h后加入淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方處理24 h）、RNAi+TCM 組（HT22 細胞轉染HAMP-siRNA-3 24 h 后加入淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方處理24 h）和Aβ+RNAi+TCM 組（加入Aβ25-35處理HT22 細胞24 h 后轉染HAMP-siRNA-3 24 h，然后加入淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方處理24 h）。根據課題組前期實驗證明，以淫羊藿、黃芪、葛根提取的有效組分復方（淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素成分按照3∶2∶2的比例用藥）。

3.2 CCK-8 法檢測淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方的細胞毒性 HT22 細胞以每孔2.5×103個的密度接種于96 孔板，用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養液進行培養，培養24 h后加入不同濃度的淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方，3 種藥物的比例按其單體的物質的量濃度確定為3∶2∶2，最終于藥物復方組分中取一定的量用于后續實驗。實驗分組為對照組和中藥組。中藥組設定藥物劑量分別為7.4、14.8、22.2、29.6 和37 mg/L，作用24 h 后，觀察細胞存活情況，在每孔中加入10 μL CCK-8 檢測試劑，避光，在37℃、5% CO2培養箱中孵育2 h，在多功能微孔板讀數儀中測定A450值，并計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組A值?空白對照組A值）/（對照組A值?空白對照組A）×100%。另外根據研究，Aβ25-35理想造模濃度和處理時間分別為40 μmol/L和24 h［10］。

3.3HAMP基因沉默

3.3.1 siRNA 的設計、合成及轉染 siRNA 由中洪博元生物技術有限公司提供，根據HAMP基因在Gen-Bank 中的序列設計合成HAMPsiRNA，如表1所示。

表1 HAMP siRNA序列Table 1.The sequences of HAMP siRNA

將HT22 細胞接種在6 孔板上，待細胞融合度達到70%時，進行轉染，具體操作按Lipofectamine?3000 轉染試劑操作說明書進行。細胞分為：正常對照（control）組、NC（轉染siRNA 陰性對照）組、Si-1（轉染HAMP-siRNA-1）組、Si-2（轉染HAMP-siRNA-2）組和Si-3（HAMP-siRNA-3）組。轉染48 h 后做Western blot和qPCR驗證。

3.3.2 qPCR和Western blot檢測HAMP表達水平按照試劑盒提取各組RNA，并反轉錄為cDNA。引物序列見表2。PCR 條件為：95℃30 s→（95℃5 s→60℃30 s）×40 個循環。待測樣品的目的基因相對表達量用2?ΔΔCt表示。

表2 qPCR引物序列Table 2.Sequences of the primers for qPCR

提取各組細胞總蛋白，BCA 法進行蛋白定量。電泳后轉移到0.45 μm 的PVDF 膜上，5%牛奶封閉2 h，加入兔抗β-actin 和兔抗HAMP，4℃孵育過夜，洗膜。滴加相應Ⅱ抗，室溫孵育1 h，洗膜顯影。采用ImageJ軟件分析測量灰度值。

3.4 免疫熒光、Western blot 和qPCR 檢測ADAM10的表達 將蓋玻片用多聚賴氨酸包被，分組處理后的細胞種植于包被好的玻片上，制備細胞爬片，然后進行造模及給藥處理。細胞爬片采用4%多聚甲醛固定20 min；1% Triton X-100 破膜，Ⅰ抗孵育過夜；PBS 洗去Ⅰ抗后，滴加相應Ⅱ抗，避光室溫孵育50 min；PBS 洗去Ⅱ抗后，滴加DAPI 染液，避光室溫孵育10 min，封片。每張片子隨機選取3個視野進行拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析。

細胞處理后，收集各組處理后的HT22 細胞，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min 使其變性。離心（1 000×g，10 min）取上清液進行SDS-PAGE。將電泳后分離的蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h。TBST 清洗，加入相應的Ⅰ抗，4℃過夜。TBST 清洗后加入Ⅱ抗，室溫下孵育2 h。TBST 清洗后ECL 顯影，于凝膠成像系統掃描拍照。采用ImageJ軟件分析測量灰度值。

細胞處理后，收集各組處理后的HT22 細胞，使用PrimeScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，以cDNA 為模板進行擴增。實時熒光定量PCR 采用TaKaRa 的TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H Plus）試劑盒進行，并用熒光定量PCR 儀進行擴增和監測，用2?ΔΔCt表示待測樣品目的基因相對表達量。ADAM10和內參照GAPDH的引物序列見表3。

表3 qPCR引物序列Table 3.Sequences of the primers for qPCR

4 統計學處理

所有實驗數據均采用SPSS 22.0軟件進行分析。數據以均數±標準差（mean±SD）來表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度的淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方對細胞存活率的影響

在進行細胞實驗之前，首先對淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方的細胞毒性進行考察，與control 組相比，不同濃度（7.4、14.8、22.2、29.6 和37 mg/L）的淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方作用于細胞24 h后，均沒有引起顯著的細胞毒性，且各組細胞存活率無顯著性差異，故采取37 mg/L 的藥物濃度用于后續實驗，見圖1。

Figure 1.Effect of traditional Chinese medicine（TCM；active components of Epimedium，Astragalus and Radix Puerariae）on HT22 cell survival rates.Mean±SD.n=6.圖1 淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方對HT22 細胞存活率的影響

2 siRNA對HT22細胞HAMP表達水平的影響

與control 組比較，NC 組HAMP 蛋白和mRNA 表達水平無顯著差異（P＞0.05），Si-1 組、Si-2 組和Si-3組HAMP 蛋白和mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與NC 組比較，Si-1 組、Si-2 組和Si-3 組HAMP蛋白和mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與Si-1組比較，Si-2 組和Si-3 組HAMP 蛋白和mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與Si-2 組比較，Si-3 組HAMP 蛋白和mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）；其中HAMP siRNA-3 序列干擾效率最強，因此選用HAMP siRNA-3序列進行后續實驗，見圖2。

Figure 2.The effect of siRNA on the HAMP protein and mRNA expression levels in HT22 cells.A：the protein ex?pression of HAMP；B：the mRNA expression of HAMP.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NC group；△P＜0.05 vs Si-1 group；▲P＜0.05 vs Si-2 group.圖2 siRNA 對HT22細胞HAMP 蛋白和mRNA 表達水平的影響

3 免疫熒光檢測ADAM10的表達

與control 組比較，Aβ 組、RNAi 組和Aβ+RNAi 組中的ADAM10蛋白表達降低（P＜0.05）；與Aβ組比較，Aβ+RNAi 組中ADAM10 蛋白表達進一步降低（P＜0.05），Aβ+TCM 組中ADAM10 蛋白表達增高（P＜0.05）；與RNAi 組比較，Aβ+RNAi 組中的ADAM10蛋白表達降低（P＜0.05），RNAi+TCM 組中的AD?AM10蛋白表達增高（P＜0.05）；與Aβ+RNAi組比較，Aβ+RNAi+TCM 組中的ADAM10 蛋白表達增高（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.Effect of traditional Chinese medicine（TCM；active components of Epimedium，Astragalus and Radix Puerariae）on ADAM10 protein expression in HT22 cells induced by Aβ.Red：AMAM10；blue：DAPI.Scale bar=20 μm.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Aβ group；△P＜0.05 vs RNAi group；▲P＜0.05 vs Aβ+RNAi group.圖3 淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方對Aβ誘導的HT22細胞中ADAM10蛋白表達的影響

4 Western blot和qPCR檢測ADAM10的表達

Western blot結果及qPCR結果顯示，與control組比較，Aβ 組、RNAi 組和Aβ+RNAi 組中的ADAM10蛋白及mRNA 表達降低（P＜0.05）；與Aβ 組比較，Aβ+RNAi 組中ADAM10 蛋白及mRNA 表達降低（P＜0.05），Aβ+TCM 組中ADAM10蛋白及mRNA 表達增高（P＜0.05）；與RNAi 組比較，Aβ+RNAi 組中的ADAM10 蛋白及mRNA 表達降低（P＜0.05），RNAi+TCM 組中的ADAM10 蛋白及mRNA 表達增高（P＜0.05）；與Aβ+RNAi 組比較，Aβ+RNAi+TCM 組中的ADAM10蛋白及mRNA表達增高（P＜0.05），見圖4。

討 論

AD 發病機制學說眾多［11］，包括Aβ 級聯學說、Tau蛋白學說、氧化應激學說和金屬離子代謝紊亂學說等［12］。腦部出現老年斑是AD 的主要病理學標志［13］，其核心成分是一種由39～43 個氨基酸殘基構成的小神經肽Aβ。AD 中Aβ 的重要形式是Aβ1-40和Aβ1-42，Aβ 斑塊中主要的成分是Aβ1-42，它更易于聚集，有很強的神經毒性，Aβ1-40是Aβ 主要的可溶性形式，主要存在于血液循環之中。Aβ25-35被認為是Aβ1-42的活性片段，于37℃水浴箱孵育7 d 左右，即為“聚集”狀態［14］。因此，在本實驗中我們采用Aβ25-35誘導細胞建立AD細胞模型。

Aβ 由其前體蛋白APP 水解代謝產生，在α、β 和γ 位使APP 發生裂解的蛋白酶分別稱之為α、β 和γ-分泌酶［15］，其中α-分泌酶是由整合素和金屬蛋白酶家族（a disintegrin and metalloprotease，ADAM）的成員ADAM9、ADAM10 和ADAM17 組成，所有成員都有相同的結構域。ADAM10 是ADAM 家族中最早就確認具有α-分泌酶功能的蛋白酶，是APP 的非淀粉樣剪切中重要的α-分泌酶。ADAM10 可以減少Aβ的形成增加其脫落，以及顯著減少淀粉樣蛋白的過度表達；相反，ADAM10表達的減少導致了淀粉樣蛋白形成增加的機會［16］。有報道顯示，中、重度AD 患者血液中ADAM10 的表達是降低的［17］。HT22 細胞是小鼠海馬神經元永生化的細胞，具有神經元的形態和功能，是近年來體外研究神經退行性病變的常用細胞。本研究以Aβ25-35誘導HT22 細胞建立AD 細胞模型，研究結果顯示AD 細胞模型組中ADAM10表達降低。

Figure 4.Effect of TCM on ADAM10 protein and mRNA expres?sion in HT22 cells induced by Aβ.A：ADAM10 pro?tein expression was measured by Western blot；B：ADAM10 mRNA expression was measured by qPCR.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Aβ group；△P＜0.05 vs RNAi group；▲P＜0.05 vs Aβ+RNAi group.圖4 淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方對Aβ 誘導的HT22細胞中ADAM10表達的影響

APP 是一種典型的金屬蛋白，其5′端非翻譯區（5′-untranslational region，5′-UTR）帶有一個功能性的鐵反應元件（iron-response element，IRE），鐵離子可通過5′-UTR 調控APP mRNA 的表達。鐵離子影響著APP 的表達及Aβ 的分泌和沉積［18］，AD 患者腦內Aβ 的產生與多種鐵離子結合蛋白關系密切。鐵代謝相關蛋白包括二價Tf、TfR1、ferritin、FPN1、Ft?Mt、DMT1、IRPs 和HAMP 等，其中HAMP 是近年來發現的重要的鐵調節激素，是維持細胞內正常鐵代謝的重要金屬轉運蛋白，它精確調控鐵吸收、儲存和釋放過程［19］。HAMP 是由25 個氨基酸組成的多肽，主要在肝臟合成并成熟，隨后分泌到血液中，轉運到它的主要靶器官包括小腸、肝臟、骨髓細胞和巨噬細胞，控制這些器官的鐵代謝活動。血液中HAMP 濃度增加，將抑制小腸上皮細胞鐵吸收蛋白的表達、進而抑制小腸鐵吸收，同時增加肝臟細胞，骨髓細胞和巨噬細胞對鐵的攝取，進而增加鐵儲存和鐵利用。通過這一HAMP 介導的途徑，可有效緩解鐵超載；反之，HAMP敲除或者濃度降低，鐵的吸收會增加，而鐵的儲存和利用減少，造成鐵超載。但其對APP 水解的影響尚未見報到。因此，本實驗以HAMP 為靶點，在AD 細胞模型中使HAMP基因沉默，觀察HAMP 對ADAM10 的影響。研究結果顯示，沉默HAMP可抑制ADAM10 的表達，說明HAMP 可調節APP 的水解，從而影響Aβ的產生。

中醫在抗癡呆方面有著豐富的臨床和實踐經驗，中藥是我國的傳統瑰寶，有上千年的悠久歷史，在病理治療中以其多靶點和多效性等優點有著巨大潛力。我們前期研究觀察，淫羊藿、黃芪、葛根有效組方可以有效緩解AD 模型小鼠腦組織鐵超載，明顯改善AD 小鼠學習記憶能力，下調AD 模型小鼠腦組織Aβ 的表達，其機制與淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方可以調節AD 模型小鼠腦組織FPN1、DMT1 和HAMP 等鐵代謝相關蛋白的表達有關［20］，但具體機制仍然不明確。本實驗在以往研究的基礎上進一步研究淫羊霍、黃芪、葛根素有效成分組方干預Aβ 表達的內在機制，研究結果顯示淫羊霍、黃芪、葛根素有效成分組方介導HAMP 上調AD 細胞模型AD?AM10的表達。

綜上所述，淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方可能通過調節HAMP 的表達，緩解腦細胞的鐵超載，促進ADAM10 的表達，從而增強APP 的非淀粉樣代謝通路，減少Aβ 沉積，這也可能是淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方防治AD 的內在機制。但本文只在細胞水平上初步探討了淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方介導HAMP 在APP 水解中的作用情況，而成功建立HAMP基因敲除小鼠，進一步在動物水平進行驗證是否對臨床有意義將是今后研究的方向。