艾灸對類風濕關節炎大鼠IL-23/IL-17炎癥軸及相關血清炎性因子的影響

郝鋒,吳立斌,劉磊,桑佳佳,吳子建,蔡榮林,胡玲,王建珠,王潔,余情,何璐

(1.南京中醫藥大學針灸推拿學院,南京 210023;2.安徽中醫藥大學,合肥 230038;3.南京中醫藥大學第一附屬醫院/江蘇省中醫院,南京 210029;4.安徽省中醫藥科學院針灸經絡研究所,合肥 230038)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種高度異質性、慢性、系統性自身免疫性疾病。流行病學調查顯示,該病男女患病比率為1:3,30～50歲為發病高峰,中國大陸地區RA患病率為0.2%～0.4%,全球患病率為0.5%～1%,年發病率為20/100萬～50/100萬人[1]。其主要病理特征為關節受累、增生性滑膜炎、骨與軟骨的破壞、關節功能喪失[2],直至殘疾,同時還會影響其他器官。其發病機制復雜,治療方面尚缺乏統一的治療方案和特異性藥物。因此,對RA發病、防治及相關療法作用機制的研究一直是該領域的熱點。研究認為炎性因子水平失調、炎癥軸IL-23/IL-17的激活引起的關節炎癥反應是 RA發生發展的重要機制之一[3-4],也是RA的治療靶點[5]。

艾灸作為中醫常用外治療法之一,對RA的療效明確,筆者前期采用隨機對照的方法,比較100例不同療程隔姜灸對活動期 RA臨床療效的影響,發現隔姜灸60 d治療對臨床癥狀體征的改善和實驗室指標的改善存在明顯優勢[6-7]。艾灸治療RA的機制和原理,值得進一步研究。本研究通過觀察艾灸對RA模型大鼠血清中白細胞介素(interleukin, IL)-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-23、IL-17和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-a, TNF-α)水平變化的影響,探討艾灸對RA模型大鼠相關炎性致損因子的干預作用,旨在從分子生物學水平揭示艾灸治療 RA模型大鼠的作用機制,為提高臨床療效提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性健康SD大鼠40只,由山東省實驗動物中心提供[許可證號為 SCXK(魯)20190003],體質量為(180±20)g,適應性喂養1周后,依照《衛生統計學》[8]隨機數字表將實驗大鼠隨機分為對照組和模型組,并將模型復制成功的實驗動物分為艾灸組、藥物組、香煙灸組及模型組,每組8只。實驗過程嚴格遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》中的相關規定對動物進行處置。

1.2 主要試劑與儀器

大鼠TNF-α ELISA試劑盒(Cusabio,G22018349),大鼠IL-1β ELISA試劑盒(Cusabio,I05018350),大鼠IL-6 ELISA試劑盒(Cusabio,I11018351),大鼠 IL-4 ELISA試劑盒(Cusabio,H30018353),大鼠IL-10 ELISA試劑盒(Cusabio,I11018354);完全弗氏佐劑(Sigma,SLBW7430);雷公藤多苷片(TPT,10 mg/片)(上海復旦復華藥業有限公司,190302);純艾條(直徑 0.9 cm,南陽市臥龍漢醫艾絨廠);酶標儀(Molecular Devices,型號SpectraMax M2e);RT-6000酶標儀(Rayto生命與分析科學有限公司,中國);JW3021HR離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司,中國);GL-88B漩渦混合器(其林貝爾儀器制造公司,中國);DNP- 9052BS-Ⅲ電熱恒溫箱(上海三發科學儀器有限公司,中國);微量移液器(Eppendorf,德國)。

1.3 造模方法

本研究采用“病證結合”的造模方法,即風、寒、濕環境因素＋生物因子復合造模方法[9],復制 RA模型大鼠。將大鼠放置在自制鋁合金、玻璃造模箱內,超聲霧化器控制箱內濕度,加入適量冰塊,使箱內環境溫度控制在(6±2)℃,濕度 80%～90%,電風扇風力定于高檔,時間持續 12 h。所有需要造模的大鼠均放入上述風、寒、濕環境中 20 d(12 h/d)(20:00—8:00)。實驗第21天用75%乙醇于大鼠左后足跖部消毒,并注射完全弗氏佐劑0.15 mL/只致炎,建立RA大鼠模型。觀察3 d,以24 h出現足踝部急性炎癥腫脹,48 h出現繼發性全身多發性關節炎,表現為前肢或對側肢體甚至耳、尾部紅腫或炎性結節出現,提示造模成功,造模時間共計23 d。

1.4 分組干預與穴位選取

1.4.1 對照組與模型組

對照組、模型組與艾灸組大鼠做同樣抓取、放置于特制懸空木架上,不做其他干預。每次20 min,每日1次,連續15 d。

1.4.2 艾灸組

選取足三里穴(左側)。根據大鼠穴位圖譜[10]作穴區定位,剪去各穴區被毛,標記顏色。模型復制成功后,抓取大鼠置于懸空木架上,使用0.9 cm直徑純艾條距穴2 cm處懸灸,并根據大鼠避讓等反應適當調整施灸距離,每日1次,每次20 min,連續干預15 d。

1.4.3 藥物組

雷公藤多苷混懸液灌胃給藥[11],濃度為1.6 mg/mL,劑量按8 mg/kg,每日1次,共給藥15 d,灌藥后與艾灸組大鼠做同樣抓取、放置于特制懸空木架上。

1.4.4 香煙灸組

模型復制成功后,抓取大鼠置于懸空木架上,選取穴位與艾灸組一致,剪去各穴區被毛,標記顏色。使用0.8 cm直徑香煙距穴2 cm處懸灸,并根據大鼠避讓等反應適當調整施灸距離,每日1次,每次20 min,連續干預15 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 關節腫脹度測量

在致炎造模后每 3天,測量各組大鼠的左后足跖的容積,計算各組大鼠足跖腫脹度[12]。

1.5.2 關節炎指數(arthritis index, AI)測定

在致炎造模后每3天觀察并記錄全身關節病變程度,每3天1次。全身病變按5級評分法評價,根據未注射佐劑的其余 3只肢體的病變程度累計積分,計算出AI。0分,無紅腫;1分,小趾關節紅腫;2分,趾關節和足跖腫脹;3分,踝關節以下的足爪腫脹;4分,包括踝關節在內的全部足爪腫脹。把各個關節的積分累計起來,即為每只大鼠的AI[13]。

1.5.3 組織病理學觀察

最后一次治療次日麻醉大鼠,腹主動脈取血,靜置,3000 r/min離心15 min,分離血清于-40℃冰箱保存備用。然后處死大鼠并取左后肢踝關節滑膜組織于福爾馬林中固定,石蠟包埋,切片進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色檢測。

1.5.4 血清 IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-23、IL-17和TNF-α水平檢測

血清樣本測定前置室溫下復融均勻,取上清液采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法測定各組大鼠血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-23、IL-17 和 TNF-α的水平。IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-23、IL-17和TNF-α試劑盒均按照說明書規范操作。

1.6 統計學方法

采用SPSS22.0軟件進行數據統計。符合正態分布的計量資料用均數±標準差表示,各組關節腫脹度、關節炎指數的比較采用兩因素重復測量方差分析(two-wayrepeatedmeasuresANOVA),由于干預分組與時間分組存在交互效應,因此比較干預分組的單獨效應。根據球形檢驗(Mauchly’stestofsphericity)采用SphericityAssumed或Greenhouse-Geiser判斷干預分組間的差異是否有統計學意義,進一步采用Bonferroni法行兩兩比較。各組血清炎癥因子水平的比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA),方差齊者采用最小顯著差異(leastsignificantdifference,LSD)法,方差不齊者采用Games-Howell法進行兩兩比較,若不符合方差齊與正態分布,采用Cruskal-Wallis秩和檢驗進行分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠關節腫脹度比較

造模后模型組、艾灸組、香煙灸組、藥物組關節腫脹度均較對照組顯著升高(P＜0.05),且模型組、艾灸組、香煙灸組、藥物組組間對比差異無統計學意義(P＞0.05)。與模型組比較,艾灸組治療后 3 d、6 d均無顯著差異(P＞0.05),治療 9 d至 15 d,均顯著降低(P＜0.05);香煙灸組治療3 d至15 d,差異均無統計學意義(P＞0.05);藥物組治療3 d至9 d均無顯著差異(P＞0.05),治療12 d、15 d均顯著下降(P＜0.05)。與艾灸組比較,香煙灸組治療3 d、6 d均無顯著差異(P＞0.05),治療9 d至15 d均顯著升高(P＜0.05);藥物組治療3 d至15 d均無明顯差異(P＞0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠不同時間左后足趾腫脹度比較 (±s,%)

表1 各組大鼠不同時間左后足趾腫脹度比較 (±s,%)

注:與對照組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與艾灸組比較3)P＜0.05

組別 n 造模后3 d 治療3 d 治療6 d 治療9 d 治療12 d 治療15 d對照組 8 0.00±0.00 0.00±0.00 0.78±2.21 1.52±2.81 1.99±2.76 1.95±2.70模型組 8 59.58±18.411) 59.58±18.41 58.80±17.47 57.50±15.60 56.82±14.69 55.45±15.21艾灸組 8 61.00±8.551) 54.15±10.02 39.49±9.67 25.03±10.152) 15.74±6.082) 9.33±4.702)香煙灸組 8 56.48±13.821) 55.82±12.84 55.13±12.31 53.19±12.343) 51.27±10.893) 47.91±11.113)藥物組 8 53.82±14.581) 47.96±13.08 39.86±9.62 30.32±9.99 20.19±8.942) 16.88±10.722)

2.2 各組大鼠關節炎指數比較

造模后模型組、艾灸組、香煙灸組、藥物組 AI均較對照組顯著升高(P＜0.05),模型組、艾灸組、香煙灸組、藥物組組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。與模型組比較,艾灸組治療6 d至15 d均顯著降低(P＜0.05);香煙灸組從治療3 d至 15 d,差異無統計學意義(P＞0.05);藥物組從治療6 d至15 d,均顯著下降(P＜0.05)。與艾灸組比較,香煙灸組治療3 d,差異無統計學意義(P＞0.05),從治療6 d至15 d均顯著升高(P＜0.05);藥物組從治療3 d至15 d均無顯著差異(P＞0.05)。詳見表2。

2.3 各組大鼠左后肢滑膜組織病理變化比較

對照組大鼠關節滑膜襯里層細胞多呈單層,排列規則,滑膜表面光滑整齊無炎性浸潤。模型組大鼠滑膜組織中有大量炎性浸潤表現,滑膜表面不整齊,滑膜增生變厚。艾灸組、藥物組和香煙灸組滑膜組織中的炎性浸潤和滑膜增生變厚現象不同程度緩解,其中艾灸組和藥物組滑膜層數減少最為明顯,香煙灸組的炎性浸潤和滑膜厚度緩解不明顯。詳見圖1。

表2 各組大鼠不同時間關節炎指數比較 (±s)

表2 各組大鼠不同時間關節炎指數比較 (±s)

注:與對照組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與艾灸組比較3)P＜0.05

組別 n 造模后3 d 治療3 d 治療6 d 治療9 d 治療12 d 治療15 d對照組 8 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00模型組 8 8.25±0.711) 8.25±0.71 8.38±0.92 8.88±0.64 9.00±0.54 9.13±0.64艾灸組 8 8.25±1.171) 7.13±1.13 6.00±0.762) 4.75±0.892) 3.75±1.172) 3.38±0.922)香煙灸組 8 8.50±1.071) 8.63±1.19 8.88±1.003) 8.25±0.893) 8.13±0.843) 8.00±1.073)藥物組 8 8.88±0.841) 8.13±0.84 6.63±0.522) 5.63±0.742) 5.00±0.772) 4.38±0.742)

圖1 各組大鼠關節滑膜組織病理比較(HE,×200)

2.4 各組大鼠血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α的水平比較

與對照組比較,模型組大鼠血清 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均有顯著上升(P＜0.05),IL-4、IL-10水平均顯著降低(P＜0.05),提示 RA模型大鼠處于炎性反應狀態;與模型組比較,艾灸組 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低(P＜0.05),IL-4、IL-10水平均出現升高(P＜0.05),藥物組 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低(P＜0.05),IL-4、IL-10水平均出現升高(P＜0.05),香煙灸組 IL-6、IL-1β水平降低(P＜0.05), TNF-α水平差異無統計學意義(P＞0.05),IL-4、IL-10水平差異無統計學意義(P＞0.05),提示艾灸組與藥物組均可降低實驗性RA模型大鼠血清中促炎性因子的水平,提升抑炎因子的水平,而香煙灸組對促炎因子 IL-6、IL-1β有抑制作用,對 TNF-α無抑制作用,對 IL-4、IL-10無提高作用;與艾灸組比較,藥物組IL-6的水平有顯著降低(P＜0.05), IL-1β水平升高(P＜0.05),TNF-α水平差異無統計學意義(P＞0.05),IL-4、IL-10均顯著降低(P＜0.05),香煙灸組 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高(P＜0.05),IL-4、IL-10均顯著降低(P＜0.05),提示艾灸組在降低 IL-1β水平優于藥物組,而藥物組在降低IL-6水平方面優于艾灸組,此兩者在降低 TNF-α、提高IL-4、IL-10水平方面無統計學差別,艾灸組在對以上抗炎、抑炎因子水平調節均優于香煙灸組;與藥物組比,香煙灸組 IL-6水平顯著升高(P＜0.05),IL-1β水平升高(P＜0.05),TNF-α水平差異無統計學意義(P＞0.05),IL-4水平顯著升高(P＜0.05),IL-10顯著降低(P＜0.05),提示藥物組在降低促炎因子 IL-6、IL-1β,提高抑炎因子IL-10水平方面均優于香煙灸組,對 TNF-α水平影響無統計學差別,而香煙灸組在提高抑炎因子IL-4水平方面優于藥物組。詳見圖2。

2.5 各組大鼠血清IL-23、IL-17水平比較

模型組大鼠血清IL-17水平較對照組顯著升高(P＜0.05),艾灸組較模型組顯著降低(P＜0.05),藥物組較模型組略有下降,但差異無統計學意義(P＞0.05),香煙灸組與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05);模型組大鼠血清IL-23較對照組顯著升高(P＜0.05),艾灸組低于模型組,差異有統計學意義(P＜0.05),香煙灸組、藥物組與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05),均高于艾灸組(P＜0.05)。詳見圖3。

3 討論

中醫學認為類風濕關節炎多因平素營衛俱虛、氣血不足、脾肝腎虧虛,易感風寒濕熱等外邪,病久痰濁瘀血膠著,進一步加重內虛,導致虛實夾雜,纏綿難愈。古今醫家多用艾灸治療本病,如《扁鵲心書》有“痹病走注疼痛,或臂、腰、足、膝拘攣,兩肘牽急,于痛處灸五十壯自愈”的記載。《本草綱目·卷十五》認為“艾葉生則微苦太辛,熟則微辛太苦,生溫熟熱,純陽也。

圖2 各組大鼠血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α水平比較

圖3 各組大鼠血清IL-23、IL-17水平比較

灸之則透諸經,而治百科病邪,起沉疴之人為康泰,其功亦大矣”。研究表明,艾灸有抗炎、鎮痛、調節代謝和調節免疫等作用,可明顯減輕炎性腫脹,提高痛閾[14-15],有效改善RA臨床癥狀及相關理化指標[16-18]。臨床觀察發現,RA患者的關節疼痛腫脹癥狀與其相關促炎性細胞因子水平成正相關[19]。

類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASF)過度增殖,在 RA發病機制中具有重要作用。RA早期 T細胞、B細胞、巨噬細胞等免疫細胞被活化,釋放細胞因子,包括IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-17、IL-23和TNF-α等細胞因子[20-23],進一步激活 RASF。RASF具有類似腫瘤細胞的特性,在關節滑膜中急劇增殖且很少發生凋亡,導致滑膜組織的厚度從正常的1至2層細胞厚增生為10至20層細胞厚,最終引起關節軟骨及骨骼破壞,導致患肢殘疾和全身并發癥[24]。

IL-1包括IL-1α、IL-1β、IL-18等,是自身免疫反應的主要介質之一,可參與炎癥細胞的活化,使 RA中慢性炎癥持續存在[25]。IL-1協助活化的炎癥細胞向病變關節移動,是介導RA中骨與軟骨組織破壞及影響骨與軟骨修復的關鍵分子之一。IL-6能增強IL-1和TNF-α等細胞因子的促炎效應,并可誘導 IL-1、IL-17的產生[26],因此IL-6可增加RA患者關節骨質破壞[27]。TNF-α主要由巨噬細胞分泌,可在IL-6、IL-17等細胞因子參與下,由 NF-κB介導產生,Wang M等[25,28]發現TNF-α可引起 Beclin-1過表達,誘導自噬相關基因的活化并啟動自噬,并進一步誘導單核細胞分化為成熟的破骨細胞,增強破骨細胞的再吸收能力,造成關節處骨質被吸收。此外TNF-α的表達還與RA的糖、脂代謝紊亂密切相關[29]。研究表明抑制 IL-1β[30]、IL-6[31]、TNF-α[32]等細胞因子的表達可調節RA炎癥反應、糖代謝與脂代謝紊亂,而艾灸可顯著下調炎癥機體IL-1β[33]、IL-6[34]、TNF-α[35]水平發揮抗炎作用。IL-17由Th17細胞分泌后可通過 NF-κB信號通路介導上述IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子的表達而進一步加重炎癥反應,致使關節水腫,滑膜增生[36]。IL-17的生成有賴于IL-23的表達,IL-23是一種主要由巨噬細胞、樹突狀細胞分泌的炎性因子,可通過 STAT3信號通路介導IL-17的產生,并能夠放大和維持IL-17的釋放[37],同時 IL-17又能正向調節 IL-23的表達,使炎癥軸IL-23/IL-17活性增強,進一步激活RANKL/RANK通路,增加破骨細胞數量,在RA后期使關節骨組織受到破壞,使病情惡化[38],研究表明 RA大鼠血清中 IL-23、IL-17水平均較健康大鼠顯著升高[39],抑制 IL-23、IL-17的表達能夠降低NF-κB與RANKL通路活性,改善RA病情[40-41]。

本研究發現艾灸“足三里”可顯著緩解 RA大鼠足跖腫脹與炎癥反應,改善局部組織炎性浸潤與滑膜增生。從時間維度上來看,從治療6 d至9 d開始,艾灸對RA大鼠的抗炎消腫作用初步顯現,從6 d至15 d治療結束,艾灸均可持續發揮作用,雷公藤多苷片也有相似的效果,兩者抗炎消腫作用相似,但艾灸改善炎性浸潤與滑膜增生的效果優于雷公藤多苷片,香煙灸抗炎消腫、改善炎性浸潤與滑膜增生的作用較弱。艾灸“足三里”可使 RA模型大鼠血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-23、IL-17水平均下降,IL-6和 TNF-α的水平下降較IL-1β更為顯著,并且IL-4、IL-10的水平均升高。這些結果提示,降低機體促炎性因子 IL-6和TNF-α的水平,降低 IL-23/IL-17炎性軸活性,提高抑炎因子IL-4、IL-10的水平可能是艾灸治療RA的效應機制之一。基于此,筆者認為艾灸可能通過降低RA大鼠促炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,下調炎癥軸IL-23/IL-17活性,提高抑炎因子IL-4、IL-10的水平,發揮治療 RA的生物學效應。有研究表明,炎癥軸IL-23/IL-17與 JAK-STAT和 NF-κB信號通路密切相關[42],關于細胞因子在艾灸治療RA的過程中發揮的作用及細胞自噬蛋白的表達和相關通路可能在艾灸治療RA中具有一定的作用,值得進一步深入研究和探討。