宮頸鱗癌組織中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1的表達變化及其意義

何洋，張蓓，龍玲艷

1徐州醫科大學研究生學院，江蘇徐州 221000；2徐州醫科大學徐州臨床學院

宮頸癌(CC)是常見的生殖系統惡性腫瘤，嚴重威脅女性生命安全[1]。正常宮頸組織→宮頸上皮內瘤變(CIN)→CC進展不但涉及高危型人乳頭瘤病毒持續感染、基因組學、表觀遺傳修飾的參與，最近發現多種癌基因激活、抑癌基因失活和一系列信號通路異常也發揮著重要的作用[2]，因此深入了解CC致病基因對探索CC發生機制、診斷治療、預后評估意義重大。細胞遷移誘導的透明質酸結合蛋白(CEMIP)又稱KIAA1199蛋白，最初被認為是一種內耳蛋白，其突變是造成非綜合征聽力損失的原因之一，近年研究發現CEMIP是一種Wnt調控蛋白，廣泛參與腫瘤細胞分化、增殖、侵襲轉移等過程[3]。β-連環蛋白(β-catenin)是Wnt/β-catenin信號通路核心蛋白，通過上調靶基因Cyclin D1的表達從而誘導腫瘤細胞增殖失控[4]。細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)與細胞增殖密切相關，正向精密調控G1/S期的轉化，在腫瘤中經常被上調或擴增[5]。近年有關CEMIP在激活Wnt/β-catenin信號通路，調控下游靶基因(c-myc、Cyclin D1)的表達，從而導致腫瘤發生的作用中日漸受到關注，但目前鮮有在宮頸鱗癌中的相關報道。2019年12月-2020年5月，我們觀察了宮頸鱗癌組織中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1的表達變化，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2013年1月—2015年1月徐州市中心醫院病理科存檔的宮頸組織蠟塊186例份。蠟塊中宮頸鱗癌組織96例份，病例均經病理證實，且均未行放化療或其他藥物治療；納入標準：病理確診，臨床資料完善，獲得患者知情同意并進行隨訪(包括門診、短信及電話隨訪)；排除標準：來源其他惡性腫瘤或轉移癌，術前進行放化療或其他治療；患者年齡22～77歲，平均年齡48.01歲；年齡<50歲54例，≥50歲42例；FIGO分期[6]Ⅰ期56例，Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期8例；腫瘤分化程度為高分化9例，中分化74例，低分化13例；腫瘤 直徑<4 cm 79例，≥4 cm 17例；浸潤深度<1/2肌層59例，≥1/2肌層37例；SCC值<2.5 ng/mL 49例，≥2.5 ng/mL 47例；無淋巴結轉移68例，有淋巴結轉移28例。Ⅱ～Ⅲ期CIN組織30例份，患者年齡22～69歲，平均年齡41.93歲。Ⅰ期CIN組織30例份，患者年齡22～65歲，平均年齡42.53歲。慢性宮頸炎組織30例份，患者年齡32～66歲，平均年齡47.26歲。本研究征得患者及家屬知情同意并簽署知情同意書，并獲得徐州市中心醫院倫理委員會批準。

1.2 宮頸組織CEMIP、β-catenin、Cyclin D1檢測方法 取各宮頸組織標本，在10%甲醛中浸泡固定，石蠟包埋，按照4 μm厚度連續切片。將石蠟切片進行70 ℃烤片1 h、二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟2次，每次10 min，梯度乙醇100%→95%→85%→75%→50%各5 min，檸檬酸鹽高溫修復抗原，內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min。鼠抗人CEMIP單抗，按照1∶75抗體稀釋液稀釋后4 ℃孵育過夜，37 ℃復溫45 min，滴加反應增強劑，孵育二抗后進行DAB顯色，蘇木素復染，酒精梯度(50%→75%→85%→95%→100%)各5 min脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。β-catenin、Cyclin D1采用上述同樣的方法進行檢測，β-catenin與抗體稀釋液按1∶50配比，Cyclin D1與抗體稀釋液按1∶75配比。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為空白對照。陽性結果判定標準：CEMIP陽性結果為棕黃色顆粒表達于細胞質中；β-catenin正常表達于細胞膜上，陽性結果為棕黃色顆粒異位表達于細胞質和(或)細胞核中；Cyclin D1陽性結果為棕褐色顆粒表達于細胞核中。免疫組化結果由2名經驗豐富的病理科醫生采用雙盲法進行判讀計分，在高倍鏡(×400)下隨機選取10個視野，每個視野計數100個細胞，按陽性細胞所占比例及染色強度計分：①陽性細胞比例：陽性細胞比例<5%記0分，5%～25%記1分，26%～49%記2分，50%～75%記3分，>75%記4分；②染色強度：無著色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；總得分=陽性細胞比例×染色強度，>3分為陽性表達，≤3分為陰性表達[7]。

1.3 隨訪方法 對96例宮頸鱗癌患者以門診、短信、電話等方式進行隨訪，隨訪指標包括患者術后生活質量、是否行輔助治療(放化療、藥物)、是否定期復查、是否有轉移灶形成及復發、是否失訪(拒絕隨訪、失去聯系、死于該病或其他疾病)等，并對收集的結果進行生存分析。以患者開始治療的時間為隨訪起始時間，2020年4月30日為隨訪截止時間。

1.4 統計學方法 采用SPSS23.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗，CEMIP、β-catenin、Cyclin D1間的相關性分析采用Spearman相關分析法，Kaplan-Meier生存分析法分析上述三指標表達與宮頸鱗癌患者生存期的關系,Cox回歸分析法分析宮頸鱗癌患者預后的危險因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各宮頸組織CEMIP、β-catenin、Cyclin D1陽性率比較 各宮頸組織中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1陽性率比較見表1，CEMIP、β-catenin、Cyclin D1在各宮頸組織中的表達情況見圖1～圖3。

表1 各宮頸組織中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1陽性率比較(%)

注：A為慢性宮頸炎組織，B為Ⅰ期CIN組織，C為Ⅱ～Ⅲ期CIN組織，D為宮頸鱗癌組織。

注：A為慢性宮頸炎組織，B為Ⅰ期CIN組織，C為Ⅱ～Ⅲ期CIN組織，D為宮頸鱗癌組織。

注：A為慢性宮頸炎組織，B為Ⅰ期CIN組織，C為Ⅱ～Ⅲ期CIN組織，D為宮頸鱗癌組織。

2.2 CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表達與宮頸鱗癌臨床病理參數的關系 CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表達與宮頸鱗癌臨床病理參數的關系見表2，由表2可知，CEMIP、Cyclin D1陽性表達與宮頸鱗癌FIGO分期、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移有關，β-catenin陽性表達與宮頸鱗癌FIGO分期、分化程度、淋巴結轉移有關(P均<0.05)。

2.3 宮頸鱗癌組織中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表達的相關性 宮頸鱗癌組織中CEMIP與β-catenin、Cyclin D1表達呈正相關(r分別為0.301、0.453，P均<0.05)，β-catenin與Cyclin D1表達呈正相關(r為0.495，P<0.05)。

2.4 CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表達與宮頸鱗癌患者生存及預后的關系 CEMIP陽性、陰性表達者5年生存率分別為26.5%、97.9%，β-catenin陽性、陰性表達者5年生存率分別為50.0%、95.8%，Cyclin D1陽性、陰性表達者5年生存率分別為47.8%、96.3%，兩者比較，P均<0.05。宮頸鱗癌患者預后單因素分析結果見表3，由表3可知，FIGO分期、分化程度、浸潤深度、SCC值、淋巴結轉移及CEMIP、β-catenin、Cyclin D1陽性表達是宮頸鱗癌患者預后影響因素；宮頸鱗癌患者預后多因素分析結果見表4，由表4可知，淋巴結轉移及CEMIP、β-catenin、Cyclin D1陽性表達是宮頸鱗癌患者預后危險因素。

表3 宮頸鱗癌患者預后單因素分析結果

表4 宮頸鱗癌患者預后多因素分析結果

3 討論

宮頸鱗癌占CC的75%～80%，早期主要臨床表現為接觸性出血、陰道流液等，晚期可發展為輸尿管梗阻、尿毒癥、癌栓脫落、惡病質等全身衰竭癥狀。雖然宮頸篩查不斷普及，但宮頸鱗癌的發生率和病死率仍較高，積極尋找高效敏感的腫瘤標志物刻不容緩。目前，Wnt/β-catenin信號通路在CC中發揮促癌作用明確，因此調控該通路相關蛋白的因子可為CC治療提供新思路。

CEMIP位于15q25位點，該位點是多種腫瘤富集區域，現已發現其在結直腸癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌[8]等惡性腫瘤中高表達，并與癌癥進展和不良預后密切相關。CEMIP可協調Wnt信號通路調控上皮間質轉化，促進腫瘤細胞增殖、侵襲和癌癥擴散等。在結直腸癌中沉默CEMIP會引起β-catenin表達降低，改變細胞周期，降低細胞增殖能力，同時發現CEMIP與Cyclin D1表達呈正相關，敲除CEMIP后Cyclin D1下降較通路中其他因子更明顯[9]，因此CEMIP可能是治療惡性腫瘤的一個新靶點。2019年研究者首先發現了外泌體CEMIP蛋白促進腦轉移中的癌細胞定植現象，即在敲除CEMIP的動物模型中，有腦轉移傾向的細胞不能在腦細胞中定植，提示靶向外泌體CEMIP可能成為預防和治療腦轉移的未來途徑[10]。研究顯示，CEMIP能通過參與PI3K-Akt介導的EMT，導致腫瘤惡性轉化[11]。XU等[12]發現，結直腸癌中CEMIP蛋白量表達高于正常組織，且主要表達于細胞質和細胞核中。SHOSTAK等[13]發現，CEMIP在CC中呈異常高表達，其通過EGFR途徑誘導CC細胞增殖、侵襲轉移，在Ⅲ期CIN中的陽性表達略高于CC。本研究顯示，宮頸鱗癌組織中CEMIP陽性率高于Ⅰ期CIN和慢性宮頸炎，Ⅱ～Ⅲ期CIN陽性率高于慢性宮頸炎；CEMIP陽性表達與宮頸鱗癌FIGO分期、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移密切相關；上述結果提示，CEMIP在宮頸鱗癌形成過程中扮演著促癌基因的作用。本研究還發現，宮頸鱗癌組織中CEMIP與β-catenin、Cyclin D1表達呈正相關，提示CEMIP可能通過調控β-catenin、Cyclin D1的表達參與宮頸鱗癌的癌變過程，我們推測CEMIP可成為宮頸鱗癌患者潛在的治療靶點，但具體作用機制還有待于進一步研究。

Wnt/β-catenin信號通路是腫瘤研究中的經典通路，異常活化可誘導腫瘤分化失控、侵襲轉移、耐藥等過程，阻斷Wnt信號通路可以抑制腫瘤發生。β-catenin位于3p21上，在多種惡性腫瘤中表達上調[14]，在正常成熟細胞中，β-catenin大部分位于細胞膜上，而在腫瘤細胞中，Wnt信號通路被激活，β-catenin與該通路上的軸蛋白、糖原合酶激酶3β、大腸腺瘤樣蛋白等形成的復合體不能被泛素化降解，β-catenin從胞膜上異位至胞質和胞核中，與細胞核內轉錄因子TCF/淋巴樣增強因子LEF家族成員相互作用，增加控制細胞分裂和生長的關鍵Wnt靶基因(Cyclin D1、c-myc)的表達，從而啟動腫瘤細胞的惡性增殖[15]，因此針對Wnt/β-catenin信號傳導是可能治療癌癥的一種有前途的策略。LI等[16]發現，β-catanin的高表達參與了乳腺癌的惡性增殖和浸潤轉移，降低β-catenin水平可以抑制腫瘤生長。LIN等[17]發現，HBX誘導的miR-5188損傷FOXO1刺激β-catenin核轉位，導致肝癌的腫瘤擴散。隨著宮頸病變進展，β-catenin表達增強并異位至胞質或胞核中，且與腫瘤分級、淋巴結轉移、預后等密切相關，在一定程度上反應宮頸鱗癌的惡性程度，可作為宮頸鱗癌患者預后的指標[18]。本研究顯示，宮頸鱗癌組織β-catenin陽性率顯著高于CIN和慢性宮頸炎，β-catenin陽性表達與宮頸鱗癌FIGO分期、分化程度、淋巴結轉移密切相關，充分體現了β-catenin在宮頸鱗癌病變進展過程中的致癌作用，抑制β-catenin的表達可減少宮頸鱗癌的發生。

Cyclin D1是Cyclins家族成員之一，在細胞周期G0期開始合成，G1中期達高峰，S期開始降解并維持低水平，與細胞周期素依賴性激酶和周期素依賴性激酶抑制因子共同調節細胞周期，對于維持細胞生長發育平衡意義重大，其異常表達會導致G1期明顯縮短，導致細胞惡性增殖[19]。Cyclin D1是目前公認的Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因，大量實驗表明Wnt/β-catenin通路激活后Cyclin D1表達上調；Cyclin D1蛋白陽性表達與子宮內膜癌組織學分級、臨床分期呈正相關，患者預后較差[20]。丁玉梅等[21]發現，CIN和CC中Cyclin D1表達升高，且Cyclin D1高表達與CC患者臨床分期高、分化程度低、淋巴結轉移顯著相關，提示Cyclin D1有潛在的評估和預后價值。LI等[22]發現，通過靶向Cyclin D1可抑制CC細胞增殖，減弱細胞成瘤性和腫瘤侵襲轉移等。本研究顯示，宮頸鱗癌組織中Cyclin D1陽性率顯著高于CIN和慢性宮頸炎，Ⅱ～Ⅲ期CIN組織中Cyclin D1陽性率顯著高于慢性宮頸炎；Cyclin D1陽性表達與宮頸鱗癌FIGO分期、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移密切相關，提示Cyclin D1可作為宮頸鱗癌治療的分子靶點。

本研究還發現，CEMIP、β-catenin、Cyclin D1陽性表達患者5年生存率較陰性患者顯著降低，CEMIP、β-catenin、Cyclin D1亦是宮頸鱗癌患者預后的獨立危險因素，因此我們推測CEMIP、β-catenin、Cyclin D1可作為宮頸鱗癌的有效預測指標。

總之，宮頸鱗癌組織中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表達升高，上述三指標可作為宮頸鱗癌的有效預測指標及潛在治療靶點。