牽張成骨過程中相關細胞因子作用的研究

黃鵬程，王新衛

(1. 河南中醫藥大學，洛陽研究生培養工作部，河南 鄭州 450000；2.洛陽正骨醫院，河南 洛陽 471000)

0 引言

牽張成骨(distraction osteogenesis，DO)首先用于人體四肢延長手術。主要是采用一種拉伸裝置，從截骨處施加一定的張力，使骨缺損區細胞的增生合成功能激活，達到促進組織再生的目的，促使骨骼伸長。20 世紀50 年代，Ilizarov 提出了“張力應激”規則，開創了牽張成骨的新時代，使骨延長廣泛應用于外傷治療骨缺損和創傷引起的肢體延伸。主要特征是一系列的細胞分子生物學變化，適當的機械牽張外力的刺激導致間質細胞向成骨細胞轉化，最后，組織趨向愈合，其間涉及到各種細胞：間充質細胞、血管內皮細胞、前成骨細胞、成骨細胞、成纖維細胞等。在此期間，間質細胞被復蘇、定向，并通過外力同源擴張，然后分化成骨形成細胞，這是新骨再生的關鍵。

考慮到牽張成骨過程中易發生感染、關節攣縮、成骨不佳、肌肉萎縮等風險[1]，存在治療周期過長的問題，作者對牽張成骨過程中的細胞因子相關作用進行了綜述，以期從中找出最佳解決方案，具體綜述如下。

1 相關細胞因子

1.1 骨形成蛋白家族(bone morphogenetic proteins，BMPs)

BMP 屬于TGF-β 超家族的一分子，最早在20 世紀60 年代被發現，并由Urist 在誘導異位成骨的實驗中進行了探索。它與許多骨生長因子中的骨誘導最密切相關。在骨骼肌肉生長過程中能夠誘導骨髓間充質干細胞(BMSc)分化，促使其向成骨細胞表達[2]，加速骨成熟與礦化。

眾多研究中，以BMP2、4、7 的研究最為常見。

1.1.1 BMP-2

BMP-2 是最重要的骨形成調節劑，在BMP 系統中它處于核心，不論在體內外都對干細胞、成骨細胞分化和骨形成具備誘導作用。

Chalmers 等[3]認為在骨與組織缺損區發生骨誘導的前提條件，必須存在三種情況：誘導劑；成骨前體細胞；合適的成骨環境。據此，我們有理由推測，在持續規律的機械牽拉刺激作用下，缺損區骨與軟組織發生應激反應，誘導BMP 強烈表達，BMP 相關受體靶細胞作用于間充質類細胞或成骨前體細胞，促使細胞分化，在血供豐富的環境中，與其他細胞生長因子相互作用，加快骨組織再生修復。Raida 等[4]研究發現BMP- 2可能作為內皮祖細胞和間充質干細胞(MSCs)之間的橋梁，銜接二者之間，促進骨再生。Mizumoto 等[5]研究發現，通過對小鼠股骨缺損區局部注射BMP-2，不僅對于新骨生成具有加速作用，它還可以增加骨密度并改善新骨的生物力學特性。

1.1.2 BMP-4

BMP-4 在BMPs 中的作用與BMP-2 一樣突出。BMP-4參與誘導成骨過程主要是通過牽拉刺激下的自身強烈表達來誘導成骨細胞和骨祖細胞的成骨分化[6]，它主要在軟骨細胞、成骨細胞和間充質細胞中表達激烈，并激活堿性磷酸酶來促進骨鈣素表達合成，進而增加礦化性骨小節的形成，以此來刺激骨的生長。

Pregizer 等[7]在研究中發現BMP-4 的轉錄在骨成熟后的骨骼重塑期間保持高度活化，表明BMP-4 對于骨發育和體內平衡是必需的。Miao Yu 等[8]在報告早發性骨質減少和骨質疏松癥患者BMP-4 突變存在的研究中發現BMP-4 可能參與人類牙齒發育和骨骼穩態。

1.1.3 BMP-7

BMP-7 類似BMP-2，有強大的誘導骨骼能力，它能夠保持軟骨細胞表型，同時促進細胞增生以及細胞外基質蛋白多糖和II 型膠原合成[9]。有學者[10]認為BMP-7 在牽張成骨中作用過程是通過將骨折周圍血腫內未分化的MSCs 向軟骨細胞以及骨細胞誘導轉化，然后經過鈣質沉積生成新骨來實現的。

廖家成等[11]認為BMP- 7 誘導成骨的作用主要是通過誘導骨膜細胞轉化成骨細胞來實現的，BMP-7 對誘導骨膜細胞增強堿性磷酸酶表達有突出貢獻，而成骨細胞可以分泌含有眾多堿性磷酸酶的基質小泡，隨著基質小泡的破裂，局部堿性磷酸酶濃度升高，形成磷酸鈣鹽，最終促進鈣化成骨。

1.2 血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor , VEGF)

VEGF 是一種同源二聚體糖蛋白，它主要分6 部分：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE 和 其 他。VEGF在牽張成骨中對破骨細胞和成骨細胞作用較大，并且正常VEGF 水平是維持正常骨重建所必需的[12]。在骨修復的炎癥階段增加的炎癥因子，如前列腺素E1 和E2、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-8(IL-8)，也誘導VEGF 表達[13]。VEGF 充當血管內皮細胞特異性有絲分裂原的角色，在促進內皮細胞生長的同時，也對血管生成有誘導作用。血管和骨細胞之間的實時通信能夠確保細胞之間保持物理接近和功能依賴性[14]。

有學者[15]在大鼠牽張成骨模型中研究牽張成骨技術對骨骼形成的影響，研究發現牽拉中期牽張力刺激下產生的內源性VEGF 能誘導成骨細胞分化，VEGF 水平因應用牽張運動而增加，與增強骨骼形成密切相關。Han 等[16]研究發現VEGF 和MSCs 作用密切，MSCs 在缺血肢體中可通過分泌VEGF，將其作用于內皮細胞，或直接參與血管再生。此外研究發現隨著牽張力的增加，牽張外力的刺激可促進VEGF 以及bFGF 的生成，這表明二者對血管神經的新生成具有促進作用，在缺損區血管生成部位不足的情況下，應用VEGF 不失為一種新的方法和思路。

1.3 堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)

bFGF 以高度保守的單體肽的身份廣泛存在于人體組織中，對胚胎發育、骨及軟骨的修復重建意義較大。而且作為一種促分裂素，bFGF 還能將不同種類的間充質細胞誘導分裂表達，在骨折缺損早期它能夠在肉芽組織中高度表達，在創傷早期加速血管內皮細胞的形成，促使組織自我修復。研究發現，在牽拉成骨過程中，通過持續規律的牽拉刺激，bFGF 活性得到增強，在成骨細胞和干細胞中表達強烈，并能夠促使骨痂形成[17]。

Zhang 等[18]在兔下頜骨缺損研究中發現，bFGF 基因轉染BMSCs 后表達增強，在兔下頜骨缺損模型中植入試驗劑，結果表明與Bio-Oss 相關的bFGF 修飾的BMSCs 比傳統方法更有效地促進新骨再生。Du 等[19]和Horikoshi-Ishihara 等[20]以及Ikeda 等[21]在研究中證實，bFGF 可明顯促進干細胞增生，血管生成和神經再生。

1.4 轉化生長因子 (transforming growth factor , TGF-B)

作為一種蛋白質多肽，在牽張成骨過程中，TGF-β 可以在牽引部位對成骨細胞進行趨化，并可以促進成骨細胞前體細胞的有絲分裂，增進軟骨細胞以及成骨細胞的增生，加速間充質細胞的分化，增加細胞外蛋白質和膠原蛋白的合成，抑制其降解。此外，高濃度的TGF-β 對促進血管生成以及Ⅰ型膠原的合成作用突出。總之，TGF-β 在牽張成骨中的作用主要體現在：促進成骨細胞的分化，加速成骨細胞的成熟，促進骨再生。

TGF-β 在血小板和骨組織中含量豐富。其在人體只存在TGF-β 1、2、3 這三種，現在人們的主要關注點仍在TGF-β1方面。作為一種調節因子，TGF-β1 在骨折剛開始發生時，就能快速啟動自我修復功能，通過促進BMSc、成骨細胞和軟骨細胞的增生表達，來促使成骨細胞的合成，以加速骨贅的增生，促進骨折愈合[22]。Ueda A 等[23]在臨床研究中證實TGF-β1、2、3 都在成骨細胞上表達，與骨折愈合相關，且只有TGF-β2 在骨膜上表達顯示陽性，這充分表明了TGF-β2 的多效成骨的特點。

1.5 類胰島素樣生長因子 (insulin-like growth factor , IGF)

在骨吸收過程中，骨基質或破骨細胞釋放出幾種成骨因子，IGF 就是其中一員[24]。IGF 作為胰島素樣生長因子，對機體生長具有調節作用，同時具有胰島素樣代謝效應，目前有兩種表現形式，以IGF-1 研究較多。

王陽等[25]認為IGF-1 在牽張成骨中主要作用于骨骺軟骨板，能加速骨的縱向生長。另有學者認為IGF-1 主要與其受體酪氨酸激酶聯合作用，上調蛋白激酶和c-Jun 氨基端激酶，與成骨細胞特異性轉錄因子(OSX)相作用，促進細胞增生分化，而且，IGF-1 可作為成骨細胞分化的頭號標志物上調Ⅰ型膠原蛋白以及堿性磷酸酶MSCs 基因表達[26]，其成骨作用可通過加速堿性磷酸酶活性表達來增強成骨細胞的活性，促進成骨。

目前，更多的研究結果表明，IGF-1 可以促進牽張成骨過程中ALP 的活性，然而，作為外源性生長因子，IGF-1 的使用還未成熟，需要進一步探尋其發生發展機制[27]。

1.6 基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)

SDF -1 屬于趨化因子蛋白家族，也稱趨化因子CXCL12，它以小分子細胞因子的身份在骨與組織中起作用。主要有兩種表現形式：SDF-1α/ CXCL12a；SDF-1β/ CXCL12 b。

SDF-1 在牽張成骨中的作用機制與骨折修復過程相像。牽拉刺激過程中，充質干細胞表面能夠表達CXCR4，促使骨膜中SDF-1 表達増加，SDF-1 能特異性趨化CXCR4 表達陽性的MSCs，參與骨組織再生修復。周恩瑜等[28]在大鼠缺損模型中，通過免疫組織化學檢測和酶聯免疫吸附測定，研究SDF-1 在牽張成骨新骨缺損中的表達及其對牽張成骨作用機制，初步研究結果示：隨著牽張的逐漸進展，SDF-1 的表達在成骨細胞和微血管周圍逐漸增加，對照組骨折中骨贅的表達顯著高于對照組。

1.7 神經生長因子 (nerve growth factor , NGF)

NGF 在神經營養素家族中位居首位，它對中樞神經系統和周圍神經系統都具備調控功能，是一種調節多種神經細胞生長和發育的蛋白質。

骨折修復重建過程中需要多方面協作參與，神經生長作為重要的一環，NGF 在骨折愈合中的作用顯得越發重要[29-30]。目前對于NGF 在牽拉成骨中的作用主要從促進BMP-2 誘導成骨方面闡述。Chaoyong 等[31]認為神經纖維生長與骨折愈合關系緊密，在牽張刺激下，NGF 能誘導缺損局部神經纖維生長，使神經肽類物質局部釋放、局部血供增加，調節炎性細胞和骨愈合相關基因，促進骨誘導。姚建華等[32]證實骨組織中有神經纖維存在，驗證了Chaoyong 等人的觀點。

有學者[33]在試驗中將NGF 局部注射在在骨缺損斷端，隨后觀測結果顯示骨痂生成速度加快，質量明顯增加，證實了NGF 在促進骨折修復方面的突出作用。

1.8 金屬基質蛋白酶(matrix metalloproteinase , MMPs)

牽張成骨過程中MMPs 的運行機制尚未明確，國外研究顯示在骨與軟骨的重塑過程中，MMPs 通過破骨細胞聚集、成骨細胞存活促進骨吸收和形成，因此，它們被作為反映骨再生和組織重塑早期生物標志物[34]。

MMPs 通過分解ECM 成分，從細胞膜上脫落生物活性分子或蛋白質修飾它們參與骨代謝和骨發生[35]。目前MMPs 研究最多的是MMP10。Reyes 等[36]在小鼠顱骨局部缺損模型研究中研究發現，MMP-10 在與BMP-2 聯合使用的情況下，可以加速骨愈合和提高礦化速率。

1.9 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase , NOS)

NOS 能夠以產生NO 或通過釋放生長因子的方式來促進骨折愈合。eNOS 和iNOS 隸屬于NOS 的三種異構體之中的兩種。eNOS 大部分在細胞膜上表達，常見于血管內皮細胞。iNOS 大部分在細胞質中表達，常見于炎癥細胞，如白細胞。eNOS 與iNOS 在牽張成骨過程中相互制約，i NOS 隨eNOS的減少而增加，兩者共同作用于骨形成和骨改建。iNOS 合成的眾多NO 對于成骨細胞增生有克制作用，而且還能夠引導其分解代謝，對破骨細胞機能有阻礙作用。

吳巍等[37]在兔下頜牙實驗過程中，通過免疫組化檢測后發現：TGF-β1 在牽張成骨過程中對eNOS 起調控作用，成正相關，通過對eNOS 調節來實現對i NOS 的調控，i NOS 又通過調控NO 濃度對TGF-β1 產生反作用，進而促進新生骨生成，促使骨折創面愈合。

2 不足與展望

牽張成骨技術自臨床實際應用以來，以其獨特的成骨理念和創新的手術方式受到了臨床醫師的一致推崇，其相關成骨理念直到現在仍然走在世界的前列，然而社會需要進步，技術同樣需要革新，在科技社會日益發展的今天，醫學事業的發展也在穩步前進，我們需要繼承發展，開拓創新。臨床實踐證實，骨缺損區骨、軟骨的生長以及血管神經的再生重建需要多種生物細胞因子參與，在單一的刺激下，僅能收到一定的效果，但卻缺乏顯而易見的臨床療效，我們有理由相信，在應用多種細胞因子及合理載體前提下，打造完整的信號通路，實現細胞分子的有機重建，這才是骨再生成功的關鍵。