嵌合抗原受體T 細胞療法在實體瘤應用的新進展

陳思名，白俊

(1.西安醫學院，陜西 西安 710021；2.陜西省人民醫院腫瘤內科，陜西 西安 710068)

0 引言

CAR-T 細胞免疫治療是一種利用抗腫瘤免疫力進行癌癥治療的免疫治療新方法。與傳統細胞介導的免疫反應相比，CAR-T 具有改良的腫瘤抗原特異性和單鏈抗體產生的不依賴主要組織相容性復合分子的細胞毒性[1]。CAR-T 細胞已證實主要在血液系統惡性腫瘤中有效，CD19 導向的CAR-T細胞治療在晚期化療耐藥的白血病和淋巴瘤患者中已顯示出令人印象深刻的臨床反應[2]。美國食品藥品管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA) 批準了兩種靶向CD19CAR-T 治療藥：Yescarta?和Kymriah?用于復發性或難治性侵襲性非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴細胞白血病和彌漫性大B 細胞淋巴瘤患者[3,4]。隨著近年來實體腫瘤的發生率的升高，CAR-T 療法在血液系統惡性腫瘤治療方面的取得的成功使得越來越多的臨床研究致力于將其擴大至實體瘤在內的其他癌癥的治療中。

1 嵌合抗原受體T 細胞(CAR-T)簡介

嵌合抗原受體(CAR)是將識別腫瘤相關抗原(tumorassociated antigen，TAA)的單鏈抗體(singlechain variable fragment，scFv)和T 細胞的活化序列在體外進行基因重組形成重組質粒，轉染至經純化和大規模擴增的T 細胞，產生所謂的CAR-T 細胞。CAR-T 細胞能夠以不依賴MHC 分子限制的方式識別腫瘤細胞上的特定靶標，誘導持久的抗腫瘤反應[5]。該特性也可有效防止腫瘤細胞通過下調MHC 的表達導致免疫逃逸的發生[6]。

通過不斷探索和改善細胞內信號傳導結構域的作用，已經產生了四代CAR-T 細胞。第一代CAR 僅包含一個細胞內信號傳導域CD3ζ 以提供信號[7]。因此CAR-T 細胞活性差，體內存活時間短。第二代和第三代CAR 則在第一代CAR 基礎上，分別合并一個或兩個共刺激信號域如CD28 或4-1BB(CD137)[8]使得CART 細胞能夠持續增殖，增強其抗腫瘤活性。第四代CART 細胞也稱為“TRUCK”細胞，其加入了細胞因子或共刺激配體能夠在腫瘤中分泌特定的細胞因子(如IL-12)，從而改變腫瘤的微環境并募集激活其他免疫細胞產生免疫應答[9]。CAR-T 細胞上的CAR 分子具有四個主要組成部分：抗原結合結構域，鉸鏈區，跨膜結構域和細胞內信號傳導結構域。

1.1 抗原結合結構域

抗原結合結構域是CAR 的胞外部分，可識別靶抗原并相應地重定向表達CAR 分子的淋巴細胞的特異性。CAR 的抗原結合結構域由單鏈抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)通過一個柔性接頭連接成單鏈抗體(scFv)組成[10]。scFv 序列通常源自鼠或人單克隆抗體，也有利用固有缺乏輕鏈的駱駝科抗體重鏈可變區(VH)設計的單域抗體(納米抗體)[11]。人scFv 噬菌體展示文庫也是scFv 序列的一個來源[12]。

1.2 鉸鏈區和跨膜結構域

CAR 分子的鉸鏈區和跨膜結構域將細胞外抗原結合結構域連接至細胞內信號傳導結構域。鉸鏈區提供足夠的柔韌性來克服空間位阻，且具有足夠的長度以利于接近靶抗原。跨膜結構域通常利用如CD3ζ，CD28，CD4 或CD8α 等將CAR分子錨定在T 細胞膜上。CD3ζ 跨膜結構域介導CAR 二聚化并摻入內源性TCR 中，這可能有助于CAR-T 細胞活化[13]。

1.3 細胞內信號傳導域

細胞內信號傳導域通常包含一個激活域和一個或多個共刺激域，主要負責信號的活化和傳導，是CAR-T 細胞發揮殺傷功能的“信號開關”。絕大多數CAR 分子通過CD3ζ 衍生的免疫受體酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)激活CAR-T 細胞。帶有CAR 的T 細胞除了激活結構域外還需含有共刺激結構域，研究最廣泛的共刺激結構域為CD28 或4-1BB(CD137)，利用其設計的CAR T 細胞產品已獲得FDA 批準[14]。

2 CART 在腫瘤中的應用

2.1 CART 在血液系統腫瘤中的應用

CD19 是目前CAR-T 免疫療法中最具吸引力的靶標，表達CD19CAR 分子的T 細胞在血液系統惡性腫瘤中取得了顯著的治療效果，其中急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL) 的完全緩解率高達90%，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma,NHL) 則高達60% 以上[15]。用于復發性或難治性侵襲性非霍奇金淋巴瘤患者的Yescarta?和用于急性淋巴細胞白血病和彌漫性大B 細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)患者的Kymriah?已獲美國食品藥品管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)批準[3,4]。在Neelapu 等人[16]進行的II 期試驗中招募了111 例B 細胞淋巴瘤患者接受抗CD19 CAR-T 細胞療法，其客觀反應率和完全緩解率分別為82% 和54%。除了ALL 和DLBCL 外，CAR-T 細胞在其他血液系統惡性腫瘤包括多發性骨髓瘤的早期臨床試驗中也顯示出了希望[17]。

2.2 CART 在實體瘤中的應用

在實體瘤中進行了許多臨床前CAR-T 細胞免疫治療試驗，但其客觀反應率不盡相同。在Hou 等[18]的一項針對262 例患者的薈萃分析表明：CAR-T 細胞療法在實體瘤中的客觀反應率為9%(95%CI：4%-16%)。Louis 等[19]在使用CAR-T 細胞治療神經母細胞瘤中發現19 名患者中有4名(52.9%)達到了客觀的臨床反應，其中3 名甚至完全緩解。NCT01454596 研究中Goff 等人[20]利用抗EGFRvIII CAR-T細胞治療淋巴結清掃術后復發的膠質母細胞瘤患者中1 例生存期達59 個月。Wick 等人[21]用抗EGFRvIII CAR-T 細胞治療復發性膠質母細胞瘤患者，10 例患者中無人對此療法有陽性反應(包括部分緩解或完全緩解)。在NCT03159819 研究中針對Claudin18.2 的CAR-T 細胞免疫療法在12 例患者(5例胰腺癌，7 例胃癌)中有1 例完全緩解，3 例部分緩解[22]。在NCT02414269[23]研究中5 例間皮瘤或非小細胞肺癌胸膜轉移患者在接受具有I-caspase-9 安全基因的抗間皮素CAR T 細胞聯合抗PD-1 治療后顯示出部分緩解。在晚期膽管癌和胰腺癌中，Feng 等人[24]針對HER2 的CAR T 細胞進行的I期研究對11 例晚期HER2 +(＞ 50%)且接受了紫杉醇和環磷酰胺化療預處理的患者進行1-2 個周期HER2CAR-T 細胞輸注，1 例患者獲得了部分緩解，5 例患者病情穩定。

3 CAR-T 在實體瘤應用中面臨的挑戰與解決方案

CD19CAR-T 在血液系統腫瘤中表現出令人印象深刻的臨床反應，然而CAR-T 細胞在實體瘤應用中的客觀反映率卻不高。我們分析在使用CAR-T 細胞治療實體瘤時，主要面臨以下三個挑戰：(1)缺乏特異性的抗原；(2)腫瘤的異質性；(3)腫瘤微環境的影響。

3.1 缺乏腫瘤特異性抗原

大多數實體瘤具有上皮起源，很難找到在腫瘤細胞表面上特異性表達而在正常上皮細胞中絕對不表達的腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen，TSA)[18]。因此通常會找在腫瘤細胞上富集但在正常組織中也低水平表達腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen,TAA) 取而代之[25]。然而靶向TAA 的藥物可產生靶上腫瘤外毒性，這限制了許多CAR T 細胞產品的臨床應用。在一項針對靶向CAIXCAR-T 細胞臨床試驗中，多名腎細胞癌患者出現肝酶異常[26]。究其原因在于CAR-T 細胞滲透到表達CAIX 的膽管上皮中，且在隨后給予抗CAIX 單克隆抗體后預防了該種情況的發生，從而提供了CAR T 細胞存在靶上腫瘤外毒性的有力證據。1 例在接受HER2CAR-T 細胞治療轉移性結腸癌的患者在細胞輸注后15分鐘出現呼吸窘迫和肺水腫，進展為多器官衰竭甚至死亡[27]。據推測，這種毒性的機制是通過CAR T 細胞識別在非惡性肺組織中表達的HER2 所致。解決CAR-T 細胞免疫治療安全性的一種方法是利用腫瘤與非惡性組織之間抗原表達水平的差異而進行親和力調整[28]。使用含較低親和力scFv 的CAR分子可以靶向在腫瘤細胞上高表達而在非惡性細胞上低表達的抗原，從而確保只有具有高抗原密度的腫瘤細胞才能提供足夠高的親和力來激活CAR T 細胞[14]。另一種方案是使用多靶點CART 細胞減少CART 細胞對健康組織的結合[29]。

3.2 腫瘤異質性

患者的腫瘤并非全部表達相同的腫瘤相關抗原，實體瘤中CAR-T 細胞治療的另一個挑戰是高度的腫瘤異質性問題。解決腫瘤異質性的可行方法是使用基因工程技術設計靶向不同抗原的多價CAR-T 細胞。如共同靶向CD19 和HER2 的CAR T 細胞在體內顯示出比具有單一靶標的CAR-T 細胞更大的抗腫瘤活性[30]。IL13Rα2 和HER2 特異性的scFv 共同形成雙特異性CAR(TanCAR)可單獨識別每種抗原以觸發激活，且在遇到兩種抗原時其功能會協同增強[31]。同樣，共同靶向HER2，IL13Rα2 和EphA2 的三價CAR T 細胞也可有效清除腫瘤細胞[32]。另一種多靶點策略是使用柔性接頭將識別CD3 的scFv與識別TAA 的scFv 連接起來，以形成分泌雙特異性抗體(bispecific Tcell engagers, BiTEs)的CAR-T 細胞。相關研究已證實，在白血病和實體瘤的臨床前模型中，分泌BiTE 的CAR-T細胞可有效克服抗原表達的異質性并避免抗原逃逸[33]。除此之外靶向與腫瘤異質性高度相關的癌癥干細胞也是一種方案。CD133 是一種被證實在許多實體瘤中過表達的新型腫瘤干細胞標記物，已成為CAR-T 細胞免疫治療研究的靶標之一[34]。

3.3 腫瘤微環境的影響

腫瘤微環境(Tumor microenvironment ,TME) 是一個復雜的腫瘤依賴性環境，主要由各種細胞外基質和基質細胞，炎性細胞和脈管系統組成。有研究發現實體瘤的TME 不僅限制了淋巴細胞的運輸和進入實體瘤的整個質量，而且還下調了其在腫瘤部位的活性，擴增和持久性[35,36]。有研究表明CAR-T 細胞的局部或瘤內應用不僅可以在腫瘤部位發揮有效且持久的抗腫瘤功能、規避致密的細胞外基質、而且還可以降低脫靶引起的全身毒性反應的風險[37]。涉及阻斷TME 中抑制性細胞Treg 細胞的分化、清除Treg、逆轉Treg 細胞的免疫抑制作用等抗腫瘤治療方法也成為了研究熱點[1]。

CAR-T 細胞活化所需的免疫刺激性細胞因子在實體瘤微環境中通常被下調[38]。由于細胞因子療法全身遞送的毒性較大，目前已開發出幾種基于基因編輯的策略來遞送較高局部水平的關鍵細胞因子如IL-12，IL-15，IL-18 和IL-21 等來實現CAR T 細胞的活化[34]。然而免疫檢查點和可溶性免疫抑制因子在實體瘤微環境中卻高度上調，并會嚴重影響T細胞的增殖和功能[39]。將CAR-T 細胞與免疫檢查點抑制劑聯合應用是實體腫瘤的治療的又一策略。目前NCT03726515研究正在進行抗EGFRvIII CAR-T 細胞與PD-1 抑制劑聯合用于新診斷的膠質母細胞瘤的臨床試驗[34]。然而一些科學家認為，干預PD-1 基因在T 細胞中的表達將不利其存活，并反過來會促進幼稚T 細胞的進一步衰竭[40]。

另有一些研究[41,42]還發現一些microRNA 或者lncRNA 對免疫過程有影響或與之相關，而對于CART 細胞治療也是如此。Ji 等人[43]的研究表明microRNA 可以抑制腫瘤細胞中的某些抑制分子間接增強CAR-T 的細胞毒性，因此使用包含microRNA的RNA 干擾技術是應對抑制性腫瘤微環境的的另一種選擇。

4 展望與未來

CAR T 細胞免疫療法應用于實體瘤開創了實體瘤免疫治療的新范例。雖然增加CAR 設計的復雜性和T 細胞的基因編輯可能會放大CAR T 細胞治療相關的風險，然而通過對基因編輯相關并發癥的持續監控將有助于進一步發現有關的風險并尋找解決方案。相信在未來，通過基因編輯技術可以更加有效地改造CAR T 細胞，為實體瘤患者提供一種新的治療選擇。