免疫膠體金技術在臨床檢驗中的應用研究進展

天津市東麗區東麗醫院（300300）孫利偉

免疫膠體金技術是氯金酸在還原劑作用下聚合成金顆粒，由靜電作用形成一種穩定的膠體狀態，即膠體金，以此作為示蹤標志物用于抗原抗體的免疫標記技術[1]。膠體金自1971年作為免疫標記物被Faulk和Taylor引入免疫化學，1989年后免疫膠體金快速檢驗技術得到快速發展[2]。免疫膠體金技術不需使用特殊設備、儀器，成本低，無特殊環境要求，且所有反應均能在15min內完善，可適應多種檢測條件，便于現場、基層使用，在激素、病毒、細菌、微生物、血清標志物等檢測中得到廣泛應用。現就其基本原理、制備方法、應用情況等進行一一介紹。

1 免疫膠體金技術的基本原理

免疫膠體金技術主要利用金顆粒的高電子密度特性，在弱堿環境下帶負電荷，能夠與蛋白質分子正電荷基團形成牢固結合，于顯微鏡下能見到黑褐色的顆粒狀，當標記物大量聚集時，肉眼即可見粉紅或紅色斑點。同時膠體金與蛋白質分子之間的結合為靜電結合，不會對蛋白質生物特性造成影響，穩定性較高。根據膠體金的高電子密度、形狀、顆粒大小、顏色反應等物理性狀，以及生物學特性，不僅能與蛋白質結合，還可與免疫球蛋白、葡萄球菌A蛋白、毒素、糖蛋白、酶、激素等結合，并能夠根據膠體金的大小展現出不同顏色，廣泛地應用于病理學、免疫學、細胞生物學、組織學等領域。

2 制備方法

2.1 膠體金顆粒制備 根據選擇的還原劑不同，可制備出不同大小的膠體金顆粒，常用制備方法主要包括鞣酸-枸櫞酸鈉還原法和枸櫞酸三鈉還原法。鞣酸-枸櫞酸鈉還原法主要用于5nm直徑的膠體金顆粒制備。枸櫞酸三鈉還原法則可根據制備過程中枸櫞酸三鈉水溶液加入量、煮沸時間的不同獲得不同大小的膠體金顆粒，主要包括10nm、15nm、18nm、20nm、30nm、50nm等不同直徑的膠體金顆粒。制備過程中應徹底清洗所需使用的玻璃器皿，最好經硅化處理，以免影響活化后金顆粒或金顆粒與生物大分子結合的穩定性。配置所使用的還原劑質量要求上乘，試劑配置保持嚴格純凈，以最大程度避免混入雜質，保障膠體金制備質量。

2.2 蛋白制備 膠體金對蛋白的吸附作用與pH值相關，若蛋白質的等電點高于膠體金pH值時，則會失去結合能力，故蛋白質的分子量會對膠體金與蛋白質的結合造成明顯影響。在待標記蛋白溶液準備時需根據標記蛋白需求調節膠體金pH值，并在結合過程中加入一定量穩定劑，以防膠體金與抗體蛋白聚合發生沉淀。膠體金標記蛋白純化包括凝膠過濾法和超速離心法，凝膠過濾法主要用于以血清蛋白作穩定的膠體金蛋白結合物的純化，超速離心法可根據不同大小的膠體金顆粒選擇不同的離心速度和離心時間。純化處理后可根據膠體金顆粒平均直徑測量及膠體金溶液的OD520nm值測定進行膠體金蛋白結合物質量測定，以保障膠體金蛋白結合物制備質量。

3 常用的免疫膠體金檢測技術

由于膠體金作為標記物制備簡便，敏感性、特異性高，無需使用放射性同位素或酶顯色底物，除應用于光鏡或電鏡的免疫組化法外，還可應用于各種液相、固相免疫分析，以及流式細胞術等。液相免疫測定是將膠體金與抗體結合，建立微量凝集試驗檢測相應的抗原。膠體金固相免疫測定主要是將斑點酶聯免疫吸附試驗與膠體金相結合，將膠體金標記作為第二抗體，通過金顆粒聚集反應形成肉眼可見斑點，便于臨床觀察。金標記流式細胞術則是利用膠體金改變紅色激光散射角，達到放大散射角的目的，且不會影響細胞活性。此外，膠體金與熒光素共同使用時彼此之間互不干擾，效果穩定。

4 臨床應用

4.1 定性檢測 定性檢測是臨床檢測方法的一種，主要通過檢測某種抗體、抗炎是否存在，判斷是否有疾病。目前應用于定性檢測的主要為斑點金免疫滲濾測定法和膠體金免疫層析法，兩種檢測方法均具有操作簡單、快速、抗基質干擾強、準確性高等優點。秦偉濤[3]研究發現，采用膠體金免疫層析法檢測人血清中EB病毒衣殼抗原IgA抗體，穩定性好，特異性、敏感性極高，均超過90%。唐嘉等[4]研究發現，采用膠體金免疫層析法定性試紙條測定人體糞便中血紅蛋白，有助于提升人體糞便潛血檢出率，便于消化系統疾病的早期診斷，敏感性高。

4.2 半定量及定量檢測 膠體金本身就具有顏色，且根據制備出膠體金顆粒大小呈現出的顏色也各有差異。臨床采用光學傳感器或肉眼，可根據顏色的深淺變化進行半定量、定量分析。

4.2.1 半定量檢測 半定量檢測是介于定性與定量之間的檢測，主要是根據電泳圖估計參照亮度一致前提下確定目標基因的表達，檢測速度較快，多應用于農藥殘留、血藥濃度測定等不太追求成分準確含量的檢測中。任劉麗等[5]研究發現，基于膠體金免疫競爭法的原理制備拉莫三嗪單克隆抗體，以膠體金進行抗體標記，可實現對拉莫三嗪血藥濃度的半定量快速檢測，且效率高、成本低，廣泛適用于基層醫療機構。宋興興等[6]研究結果顯示，采用葛根素膠體金試紙，以半定量限為34μg/ml評價葛根藥材質量，檢測速度快、準確性高，說明免疫膠體金技術在原料中藥采購快速檢驗中具有較高的應用價值。

4.2.2 定量檢測 定量檢測是測定物質中相關組分含量，在各種病理診斷中具有較高的應用價值。隨著免疫膠體金檢測技術的不斷發展、完善，膠體金免疫定量檢測儀的出現實現建立一種新型快速定量檢測方法。免疫膠體金快速定量檢測主要是基于硝酸纖維素膜上檢測線顏色深淺變化與檢測物濃度呈一定關系，可將光學傳感器掃描結果與標準曲線相對比，進而得到定量分析結果。膠體金定量檢測試紙條顯色屬于動態變化過程，試紙工藝、待測樣本差異性及檢測時環境均可對顯色結果造成影響，需做好質量控制。同時采用檢測線/標準曲線比值進行定量分析也可在一定程度上控制溫度、樣本等對顯色的影響。張蘭蘭等[7]研究發現，根據抗人妊娠相關血漿蛋白A(PAPP-A)單抗細胞株篩選配對抗體后，建立免疫膠體金快速定量檢測方法，與人甲胎蛋白、人胎盤催乳素、人泌乳素、人絨毛膜促性腺激素等不存在交叉，為產前診斷提高診斷率。免疫膠體金技術定量檢驗在新冠肺炎快速檢測中也發揮較良好效果。寧樂平等[8]以核酸檢測結果為標準進行研究，發現兩種膠體金免疫層析技術試劑在新型冠狀病毒定量檢測診斷中的敏感度、特異性、陽性預測值、陰性預測值均超過95%，可作為核酸檢測的重要補充。免疫膠體金技術定量檢測不僅可用病理、生理指標測定，還可用于藥物成分、毒藥殘留量等測定中。李耀磊等[9]研究發現，膠體金免疫層析技術在中藥材中對黃曲霉毒素B1定量檢測性能較好，在中藥材質量、毒性評價中具有較高的應用價值。

4.3 多項聯合檢測 多項聯合檢測技術在同時進行多種成分檢測，能夠節省成本、時間，是未來臨床檢驗的發展方向。黎明等[10]研究結果顯示，采用免疫膠體金法、酶聯免疫吸附法、生物酶聯免疫吸附試驗聯合檢測，在早期糖尿病腎病診斷中的準確性較單一檢測更高。岳曉紅等[11]研究發現，膠體金法、實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術、酶聯免疫法在兒童肺炎支原體感染檢測診斷中具有較高的診斷價值，各種方法之間是一種互相補充關系，聯合診斷準確性更高。

5 小結

免疫膠體金技術作為一種新型的免疫標記技術，較免疫熒光技術、免疫酶標技術、放射免疫技術更加快捷、方便，適用于基層醫療機構或現場檢測，免疫膠體金技術定量分析儀則提升該技術臨床診斷的準確性。但免疫膠體金技術較其他檢測方法靈敏度、陽性檢出率等存在一定差異。同時膠體金免疫定量檢測儀則會受到檢測環境、待檢物質差異性等的干擾，存在明顯局限性。但隨著免疫膠體金技術持續發展，臨床可根據該技術的應用現狀持續完善膠體金制備體系，建立更加科學的評估標準，研發更高效、高質量的免疫膠體金技術定量分析儀，應用前景較好。