末端結合蛋白1的生物信息學分析

唐陶

（川北醫學院醫學檢驗系，四川 南充）

0 引言

末端結合蛋白1（human end-binding protein 1,EB1），由微管關聯蛋白RP/EB家族成員1（microtubuleassociated protein RP/EB family member 1,MAPRE1）基因編碼,為末端結合蛋白家族重要成員之一。EB1蛋白定位于生長中的微管末端，可以招募其他微管相關蛋白，在微管組裝和微管動態性調節過程中發揮著極其重要的作用，參與有絲分裂、細胞遷移、細胞形態形成等以微管為基礎的細胞活動。研究報道EB1在多種癌癥組織（胃癌、肝細胞癌、乳腺癌、食道鱗狀細胞癌）過表達[1]，不僅預示著腫瘤的發展及預后，也影響化療敏感性，可作為腫瘤診斷、治療、預后標志物及治療靶標。本研究利用生物信息學技術對人EB1蛋白進行了結構和功能方面的分析，為進一步研究EB1蛋白在腫瘤中的分子功能提供思路。

1 材料

分別在NCBI-gene數據庫和Uniprot數據庫中檢索人EB1基因及蛋白，其GENE ID為：22919，mRNA序列號：NM_012325.3（GI號：1519311506），EB1蛋白氨基酸序列號：NP_036457.1(GI號：6 912494；Uniprot檢索號：Q15691)。

2 方法

2.1 EB1蛋白理化性質分析

利用ORFfinder查找人EB1開放閱讀框。在ProtParam數據庫（https://web.expasy.org/protparam/）分析EB1蛋白分子量、酸堿性和不穩定指數等理化性質。利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）在線工具分析EB1蛋白的親水性和疏水性（window size為15）。

2.2 EB1信號肽、跨膜結構、磷酸化修飾位點及亞細胞定位分析

分別利用SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）、TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、NetPhos 3.1 server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測EB1信號肽及跨膜結構及磷酸化位點。在genecards (https://www.genecards.org/)數據庫查詢EB1亞細胞定位。

2.3 EB1蛋白結構分析

使用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在線工具預測EB1蛋白二級結構。在pfam(http://pfam.xfam.org/)數據庫分析EB1蛋白結構域。SWISSMODEL(https://swissmodel.expasy.org/)同源建模法預測EB1蛋白三維結構。

2.4 EB1蛋白互作

通過string網站預測EB1互作蛋白，置信度設置為0.7。在reactome數據庫查詢EB1參與信號通路。

2.5 EB1在腫瘤中的表達及生存分析

在Gene Expression Display Server查詢EB1/MAPRE1在各種腫瘤中的表達水平。利用Kaplan-Meier Plotter繪制生存曲線。

3 結果

3.1 EB1的理化性質

EB1的mRNA序列得到的ORF共21個，最長的為ORF1，共807bp，編碼268個氨基酸。ORF1編碼序列與EB1氨基酸序列一致。EB1蛋白分子量為29999.08，蛋白質的總分子式為C1340H2099N355O408S9,原子總數為4211。含有268個氨基酸殘基，帶負電荷的殘基總數為（Asp+Glu）39個，帶正電荷的殘基總數（Arg+Lys）31個。理論等電點為5.02,說明蛋白偏酸性。EB1蛋白的不穩定指數為35.16，為穩定型蛋白。EB1蛋白的脂肪指數為81.16，親水性的平均值為-0.427，說明該蛋白為親水性蛋白。ProtScale分析結果為EB1蛋白疏水性評分最高為1.1，親水性評分最高為-1.8。EB1蛋白親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，表明EB1蛋白屬于親水性蛋白。

3.2 EB1信號肽、跨膜結構、磷酸化修飾位點及亞細胞定位

SignalP4.1、TMHMM分析結果顯示EB1不存在信號肽和跨膜區。NetPhos 3.1預測EB1蛋白磷酸化位點較多，以得分>0.7計，分別為16/155/156/165位的絲氨酸、71/124/268位的酪氨酸和166位的蘇氨酸。genecards顯示EB1主要定位在細胞骨架、細胞質，置信度評分為5。

3.3 EB1蛋白結構

EB1蛋白二級結構中，無規卷曲和α螺旋占比最高，分別為133個（49.6%）、128個（47.8%）。pfam數據庫結果顯示MAPRE1蛋白有2個結構域，分別是位于N端的鈣調蛋白同源（calmodulin homology，CH）結構域及C端的末端結合蛋白同源（EBH）結構域。CH結構域可介導MAPRE1與微管相互作用。EBH結構域可介導MAPRE1與含有SxIP序列的微管相關蛋白如APC、ACF7/MACF1、CLASP1/2相互作用。SWISS-MODEL軟件得到1個EB1三維結構標準模型，該模型與模板1vka.1.A序列相似性100%，該蛋白無配體。

3.4 EB1蛋白互作

String蛋白互作分析按得分>0.9者，共得到10個EB1互作蛋白：MAPRE3、CKAP5、DCTN1、CLIP1、DST、AKAP9、AURKA、AURKB、KIF2C、TUBB。Reactome數據庫顯示EB1參與6種信號通路，包括細胞周期檢測點、有絲分裂間期/前中期/中后期、Rho GTPases通路和Cilium Assembly通路。

3.5EB1在腫瘤中的表達及生存分析

GEDs數據庫結果顯示EB1在直腸腺癌（rectum adenocarcinoma,READ）、多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）、結腸腺癌（colon adenocarcinoma,COAD）、肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）、乳腺浸潤癌（breast invasive carcinoma,BRCA）、食管癌（esophageal carcinoma,ESCA）、胃腺癌（stomach adenocarcinoma,STAD）、肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）、膽管癌（cholangiocarcinoma,CHOL）、肝細胞癌（liver hepatocellular carcinoma,LIHC）中高表達；但在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)、甲狀腺癌（thyroid carcinoma，THCA）等腫瘤中低表達或表達差異不明顯。Kaplan-Meier Plotter數據庫顯示，EB1/MAPRE1高表達乳腺癌、肺癌、胃癌及卵巢癌患者生存率較低表達患者明顯下降，差異有統計學意義(P<0.001)。

4 討論

本研究依托生物信息學分析人EB1蛋白，預測EB1蛋白是偏酸性穩定型親水性蛋白。EB1蛋白互作蛋白中，MAPRE3編碼末端結合蛋白3，該蛋白也是末端結合蛋白家族成員之一，在腦、骨骼肌中高表達，其N端與微管末端相互作用，C端可與APC（adenomatous polyposis coli）同源物APCL相互結合。作為微管末端結合蛋白，EB3定位于微管正極端抑制微管解聚以穩定微管，參與軸突生長和細胞間黏附等生物過程[2]。Kim[3]發現高度微衛星不穩定性胃癌及結腸癌發生MAPRE3基因框移突變（p.Cys182AlafsX31;p.Cys182LeufsX16）頻率顯著高于低高度微衛星不穩定性，差異具有統計學意義（P=0.001）,但進一步分析發現突變的出現與組織學分級、臨床分期、轉移及生存期無明顯關系。目前關于MAPRE3的報道主要集中在神經系統領域，關于MAPRE3與腫瘤發生發展機制關系還待進一步研究。細胞骨架相關蛋白5（cytoskeleton—associated protein 5，CKAP5),由ch-TOG基因編碼，是含有TOG或TOG樣結構域微管末端示蹤蛋白代表成員之一，但它和EB1蛋白具有不同的微管結合模式。CKAP5可穩定紡錘體微管并可調節中心體微管，促進雙極紡錘體的形成。CKAP5的異常表達使中心體微管聚合物顯著減少，導致多極紡錘體形成，促進癌癥的發展[4]。據報道，CKAP5表達在結腸和肝臟腫瘤較正常組織顯著增加。Yu等[5]研究也發現CKAP5在肝細胞肝癌中相較于癌旁組織表達明顯增加，且高表達預示著降低的總生存期。DCTN1編碼p150glued蛋白，該蛋白可通過N端的CAP-Gly結構域與EB1、EB3結合，參與有絲分裂、紡錘體形成、細胞核定位、胞內大分子的運輸和定位等多種生物進程。DCTN1與脊髓側索硬化癥、遠端運動神經病變VII B型、佩里綜合征的發病有關[6]。CLIP1蛋白N端可與EB1相互作用從而使其定位在微管正末端，C端結構可與P150glued蛋白直接結合，與有絲分裂等細胞功能密切相關。研究發現CLIP1無義突變可能導致智力缺陷的發生，這可能是因為CLIP1參與神經元發育有關[7]。AKAP9編碼的AKAP350和AKAP450主要定位于中心體，與微管組裝及介導的運動有關。研究發現AKAP9基因突變與胃癌、直腸癌等多種癌癥發病有關[8]。Aurora蛋白激酶包含AURKA、AURKB及Aurora-C,這三種Aurora蛋白激酶相互結合，在細胞有絲分裂和減數分裂生物過程中發揮重要作用，研究發現AURKA、AURKB在多種癌癥如乳腺癌中高表達，且與預后不良相關[9]。

Dong等[10]發現，EB1在乳腺癌組織呈現高表達狀態，同時觀察到EB1表達水平與乳腺癌患者組織學分級、臨床分期及淋巴結轉移明顯相關，且影響乳腺癌對紫杉醇化療敏感性。研究發現EB1在肺癌組織中高表達，EB1陽性肺癌患者總生存期和3年生存率均顯著低于EB1陰性肺癌患者[11]。研究發現EB1和AURKB在卵巢癌中陽性表達率顯著高于卵巢正常組織，EB1、AURKB陽性表達者卵巢癌患者總生存率明顯縮短[12]。上述研究與本文GEDs、Kaplan-MeiMer plotter數據庫結果一致。

綜上所述，本文通過生物信息學分析人EB1蛋白結構、功能，發現EB1參與腫瘤發生發展預后過程，但由于EB1信號傳導極其復雜，參與多條信號通路，了解EB1蛋白分子結構，為研究其與腫瘤發展的許多潛在機制提供新思路。