微納米級微塑料及其添加劑復合效益對藍藻的生長及葉綠素熒光的影響

馬 欠，郭鋒鋒，鄧 敏，劉 燕，趙 菊，晁江琴，沈 波

(昭通學院 地理科學與旅游學院，云南 昭通 657000)

自20世紀50年代以來，塑料制品由于在日常生活和商業活動中的廣泛用途，已成為人類活動不可或缺的一部分。1970年代，美國國家科學院估計每年流入世界海洋的塑料通量為4.5萬噸，相當于全球塑料產量的0.1%，2010年全球塑料的年產量已達2.65億噸。人們對海洋中當前塑料存儲量的估計是1970年代對釋放到開放海洋中的漂浮塑料的保守一階估計的100倍[1]。

進入環境中的塑料會逐漸破碎，最終形成更小的碎片，粒徑小于5mm的塑料碎片和顆粒稱為微塑料[2]。塑料及其相關的化學同源物進入陸地和水生棲息地，環境中微塑料的存在已在水生和陸地生態系統中得到廣泛應對和證實[3]。現有研究中發現微塑料的存在對整個生態系統構成了巨大的威脅，對海洋、湖泊、河流、沿海地區甚至極地地區都產生了巨大的影響[4]。有學者發現塑料會破碎成微納米級微塑料，研究微納米級微塑料成為國際國內的趨勢[5-6]。

浮游生物作為水中食物鏈的最基礎一環，對于水生態系統功能維系具有關鍵作用[7-8]，浮游植物是水生生物的物質基礎[9]。葉綠素熒光分析技術以光合作用理論為基礎，利用體內葉綠素為天然探針，研究各種植物光合生理狀況及外界因子對其影響的活體測定和診斷技術。葉綠素熒光動力學技術是用于評鑒作物耐受逆境能力的一項熱門技術，被稱為測定環境脅迫下響應快速、無損傷的探針[10]。1931年，德國Hirsch和Kautsky發現，綠色植物的葉片、藻液等經過暗適應一段時間后，經可見光照射，綠色植物葉片或藻類會發出微弱的暗紅色的熒光信號，熒光信號的強弱隨時發生變化，這個變化過程也稱為葉綠素熒光動力學，即Kautsky效應[11]。

對于葉綠素熒光，多數文獻主要是對光響應曲線(OJIP)中Fv/Fm這一指標進行解讀，并未充分考慮能量分配比率和反應中心比活性參數[12-13]。以微納米微塑料及其添加劑對藻的生長及葉綠素熒光的影響為主要研究對象，結合相關研究，重點研究微納米級微塑料對藍藻的生長及其葉綠素熒光的影響。此外，考慮到現實環境中塑料材質基本上添加有多種添加劑，因此也對具有多種添加劑的不同微納米級微塑料對藻的生長及其葉綠素熒光進行研究。通過對微塑料材質進行萃取，檢測塑料添加劑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的藻種為集胞藻，購自中國科學院武漢水生生物研究所，營養液選用BG-11培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 集胞藻的培養和實驗過程

采用BG-11培養基進行培養，預選藻種為集胞藻作為受試藻。配置5L培養基作為調試藻密度的營養液，所有玻璃器皿都經過滅菌鍋消毒處理。初始藻的密度控制為0.11(以吸光度表示)，選用3種微塑料尺寸分別為200μm,300μm和5mm。為了驗證微塑料尺寸絕大多數處于該尺寸，使用體式顯微鏡做粒徑分析，設置進入藻液的微塑料最終濃度為5mg/L和250mg/L。研究不同濃度對藻的影響，微塑料濃度分別設置為0，0.5，5，10，25，50mg/L，每組設置3個平行樣。測定時間為1，12，24，48，96h。每天搖晃錐形瓶3～5次，然后取樣測定藻的吸光度、葉綠素a、光響應曲線(OJIP)。

1.2.2 各參數的測定

(1)微塑料添加劑的測定

取非純及純的微塑料1g,倒入帶玻璃蓋的小試管中，然后加入乙腈飽和正己烷10mL。超聲1h，然后靜止12h，過0.22μm的有機相濾膜。放入棕色測樣瓶，待測。設置氣相進樣口溫度為250℃，初始溫度為80℃。升溫至280℃，保持15min。設置質譜掃描范圍45～450，與氣相運行時間一致。通過匹配庫進行塑料添加劑的判斷。針對增塑劑類選擇離子峰149作為判定鄰苯二甲酸酯的判斷峰。

(2)OD值的測定

被檢測物吸收的光密度，也稱為吸光度，檢測單位用OD值表示。實驗開始后在規定時間取樣1次，吸取2.5mL于比色皿中，紫外分光光度計測量其OD值，空白校準用BG-11營養液。

(3)葉綠素熒光參數的測定

取2.5mL藻液放入比色皿中，暗適應5min后，用葉綠素熒光儀(FL3500,PSI,捷克)直接測得。

1.3 數據處理分析

應用SPSS20.0軟件對數據進行分析，用origin8.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度和尺寸純微塑料共同脅迫對集胞藻生長及葉綠素熒光的影響

不同尺寸純微塑料對集胞藻OD值的影響見圖1。微塑料粒徑分別為200um,350um和5mm，濃度設置為50mg/L和250mg/L。從圖1中可以看出，不同尺寸對吸光度值的影響較小，微塑料濃度為250mg/L和粒徑為200um時的OD值相對較低，空白組以及藻液微塑料濃度250mg/L和粒徑5mm組的OD值相對較高。說明粒徑的大小對微藻生長有一定的影響，當微塑料濃度相同時，微塑料粒徑越小對微藻生長的脅迫作用越明顯。72h測得微塑料濃度-粒徑分別為50mg/L-200um，50mg/L-350um，250mg/L-200um，250mg/L-350um，250mg/L-5mm時，微藻OD值分別為0.42，0.41，0.41，0.42，0.42。OD值相對較低的兩個組為50mg/L-350um和250mg/L-200um組，說明微塑料濃度對微藻生長影響較小，微塑料粒徑越小對微藻生長的抑制作用越明顯。

圖1 不同尺寸微塑料集胞藻OD值的影響

不同尺寸純微塑料對集胞藻葉綠素熒光值(Fv/Fm)的影響見圖2。

圖2 不同尺寸微塑料集胞藻Fv/Fm的影響

72h前，Fv/Fm值相對較低的組是微塑料濃度和粒徑為250mg/L-200um組，在相同的濃度條件下，粒徑最小的組Fv/Fm最低。微塑料粒徑相同時，不同微塑料濃度下Fv/Fm變化不明顯。50mg/L-200um組與250mg/L-200um組相比較，在相同的微塑料粒徑脅迫下，250mg/L-200um組微藻Fv/Fm比50mg/L-200um組相應變低，說明高濃度微塑料對微藻生長產生一定的抑制作用。對比250mg/L-200um，250mg/L-350um和250mg/L-5mm組，Fv/Fm值最低的是250mg/L-200um組，在同樣的微塑料濃度條件下，微塑料粒徑越小，對微藻生長的抑制作用越明顯。從6組數據可以看出，Fv/Fm最低的是250mg/L-200um組，即微塑料濃度最高和粒徑最小組，說明微塑料高濃度低粒徑對微藻生長的抑制作用最明顯。

2.2 不同濃度純微塑料對集胞藻吸光度值(OD680 )的影響

分別在裝有藻液的三角瓶中添加增塑劑DEHP。DEHP為無色無臭液體，不溶于水，溶于乙醚、乙醇、礦物油等，由辛醇或異辛醇(2-EH)和鄰苯二甲酸制成。將DEHP濃度分別設置為0，0.5，5，10，25，50mg/L，測微藻OD值的變化，判斷不同濃度微塑料對微藻生長的影響。從圖3中可以看出， 微藻OD值增長最快的為空白組，增長最慢的為增塑劑濃度設置為25mg/L組和50mg/L組，兩組高濃度增塑劑對微藻生長產生一定的抑制作用。通過分析可知，96h時，增塑劑濃度為0.5，5，10，25，50mg/L組的OD值分別比空白組減少了4.44%，8.19%，1.87%，17.36%，18.54%。50mg/L組OD值減少量最高。由此可知，微塑料對微藻的生長產生一定影響，且濃度越高對微藻生長的抑制作用越明顯。

圖3 不同濃度微塑料集胞藻OD680的影響

不同濃度DEHP對集胞藻葉綠素熒光值(Fv/Fm)的影響見圖4，DEHP濃度分別為0，0.5，5，10，25，50mg/L的6個組中，Fv/Fm下降最不明顯的組是空白組，沒有添加增塑劑；下降最明顯的組是DEHP濃度為25mg/L和50mg/L組，說明DEHP濃度為25mg/L和50mg/L時對集胞藻的生長產生抑制作用。除了空白組Fv/Fm緩慢上升外，其他濃度組都以不同程度下降，濃度越高下降越明顯，說明微塑料濃度越高對微藻生長的抑制作用越明顯。

圖4 不同濃度微塑料集胞藻Fv/Fm的影響

不同濃度微塑料對集胞藻葉綠素a的影響見圖5。從圖5中可以看出DEHP濃度分別為0，0.5，5，10，25，50mg/L的幾個組葉綠素a的變化趨勢不明顯，只有濃度最高組在24h和120h為最低值，其他濃度組變化不明顯。說明微塑料需要達到較高濃度，對微藻葉綠素a才能產生影響。

3 討論

自20世紀50年代大規模生產塑料以來，塑料產量每年逐漸接近3億噸。估計到2050年，塑料產量會增加至330億噸。塑料產量增加的同時，塑料垃圾的排放量也在日益增加，并且通過偶然的排放和不加區分的丟棄物的隨意處置，塑料垃圾在環境中以無法控制的速度累積。在自然環境下，這些塑料垃圾由于物理、化學及生物活動可以慢慢降解為極小的顆粒，分散、匯聚在海洋、湖泊、河口、河底及生物體中，甚至有可能被遷移到地下系統中。有學者研究這種尺寸較小的塑料碎片(微塑料)沉積體和一些浮游生物的比例相同，它們可能對廣泛的生物體具有生物可利用性，在一定程度上會帶來一些不利的環境效應。

圖5 不同尺寸濃度微塑料集胞藻葉綠素a的影響

設置不同的微塑料濃度和不同的微塑料粒徑，在固定的時段測量微藻的OD值、葉綠素熒光值、葉綠素a，通過測量可知，微塑料粒徑大小和不同濃度均會對微藻的生長產生一定的影響，當濃度一定時，微塑料粒徑越小對微藻生長的抑制作用就越明顯，當粒徑大小一定時微塑料濃度越高對微藻生長的抑制作用越明顯。在濃度和粒徑共同脅迫實驗組中，集胞藻生長明顯變緩，說明集胞藻生長受到抑制，在濃度組實驗中，當微塑料濃度大于10mg/L時，濃度越高集胞藻生長受到的抑制作用就越明顯。