Nrf2在黃芩苷抗氧化作用中的調控機制探析

楊詩鈺

（成都中醫藥大學，四川成都 611130）

黃芩是中醫臨床中的常見藥物，早在《神農本草經》中便有記載，主要有清熱瀉火、解毒安胎等功效。通過現代藥理學的探究，黃酮類成分被證明是黃芩的主要成分，包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等。黃芩苷是植物黃芩中提取出的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎癥、抑制細胞凋亡等作用，在治療心肌梗塞和心臟搭橋手術中可以抑制心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的發生。黃芩苷的抗氧化作用機制是現代藥理學的重點方向之一，而其抗氧化機制的核心是對Nrf2（NF-E2相關因子，Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2）核因子的調控作用。

Nrf2是調控細胞氧化反應的核心轉錄因子，通過對抗氧化反應蛋白原件（AREs）活性的誘導，抑制氧自由基（ROS）造成的氧化應激損傷，保護細胞內的穩定環境[1]。研究表明，黃芩苷通過調控Nrf2的轉錄活性來改善機體的氧化應激情況，本文主要對近年來的文獻進行研究，就黃芩苷調控Nrf2的具體信號通道和抗氧化作用機制進行歸納。

1 黃芩苷的分子結構

黃芩苷（Baicalin）是從唇形科多年生植物黃芩（Scutellaria BaicalensisGeorgi）中提取出的一種黃酮類化合物。黃芩苷是黃芩的核心活性作用成分，化學分子式為C21H18O11（圖1），為淡黃色粉末，其結構中有酚羥基存在，結構的不飽和度為11，熔點223～225 ℃[2]。黃芩苷被廣泛應用在高血壓、冠心病等相關疾病的治療中，主要是通過影響細胞內酶的活性、調控蛋白質的轉錄、調節細胞內相關聯的細胞因子表達這3種作用方式，來實現其抗氧化、抗炎癥、抑制細胞損傷和凋亡等療效和保護作用。

圖1 黃芩苷化學分子式

2 黃芩苷調節下的Nrf2抗氧化機制

抗氧化功能是黃芩苷的主要作用之一，其核心機制在于調控Nrf2因子，進而影響抗氧化蛋白反應原件的轉錄，調控超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、血紅素氧合酶 1（Heme Oxygenase-1，HO-1）、機體內的谷胱甘肽（L-γ-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH）和NAD(P)H：醌氧化還原酶1（NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1）的表達，達到清除細胞內多余自由基、保護細胞在缺氧/復氧情況下免受損傷的目的。

如圖2所示，Nrf2主要受到kelch樣ECH相關蛋白1（Keap1）、泛素鏈接酶蛋白（cullin E3，cul3）和自噬蛋白（protein 62，p62）的調控，其在正常情況下為復合蛋白結構。其中，Keap1/Nrf2是Nrf2的主要受控信號通路，Nrf2和Keap1蛋白通過DLG和ETGE兩個域結合。在缺氧/復氧條件下，細胞的自我保護機制會提高Nrf2的表達，增加核內Nrf2聚集含量。細胞核內的Nrf2因子能夠促進抗氧化蛋白反應原件的基因轉錄，從而提高細胞內抗氧化蛋白的含量，清除細胞內的氧自由基，抑制細胞的過氧化反應。黃芩苷主要通過keap1/Nrf2、cul3/Nrf2和p62/Nrf2三種方式來對Nrf2因子進行調控，激活其抗氧化機制，從而抑制氧化作用帶來的細胞損傷。

3 激活Nrf2的上游調控因子

3.1 keap1/Nrf2

Keap1是激活和調控Nrf2分子的調節器，通過keap1上的N末端結構域實現與Nrf2之間的相互作用。在正常狀態下，keap1與DLG位點結合并導致Nrf2被降解；而氧化應激反應下，keap1無法與DLG結合并降解Nrf2，新合成的Nrf2即可在細胞核內聚集并產生作用[3]。高善頌等[4]研究發現，黃芩苷可以通過調控keap1/Nrf2信號通路，從而進一步調節SOD、GSH、CAT等抗氧化酶的活性。Li等[5]提出黃芩苷可能通過修飾keap1蛋白復合物來下調keap1蛋白活性，保證Nrf2的表達，從而在氧化應激損傷中保護心臟，Hong等人[6]和Guo等人[7]研究發現黃芩苷可以干預Nrf2和Keap1之間的聯系，防止Keap1抑制Nrf2的表達，保護Nrf2與抗氧化劑反應因子結合來激活各種抗氧化基因并提高AREs的活性。

3.2 Cul3/Nrf2

Cul3是殘余E3泛素連接酶復合物的支架蛋白，其過度表達會使Nrf2多聚泛素化，抑制Nrf2的蛋白表達。Keap1和Cul3之間通過BTB域相互作用，共同維持Nrf2在正常狀態下的降解，當Cul3與keap1相互作用的域界面發生突變時，則會導致keap1活性下調。Kobayashi等[8]研究證明敲除Cul3可以抑制Nrf2多聚泛素化。Yu等[9]研究發現通過調控miR-101，可以下調Cul3 mRNA的表達，并大幅上調Nrf2和HO-1的表達。Cuadrado等[10]提出在收到氧化刺激時，RING蛋白（Ring-box 1，RBX1）的Keap1-Gul3-RBX1蛋白復合體會被破壞，從而導致Nrf2堆積并起到抗氧化的作用。Sun等[11]提出keap1可以通過Cul3泛素化Nrf2并將其降解。盡管Cul3在調控Nrf2的過程中起到重要作用，目前黃芩苷Cul3/Nrf2通路的相關研究較少，僅有Zhou等[12]證明在黃芩苷激活Keap1-Nrf2系統的過程中，通過干預Cul3和keap1的聯接，從而降低Nrf2泛素化。

圖2 黃芩苷調控Nrf2的抗氧化機制

3.3 p62/Nrf2

p62是一種自噬蛋白，可以表征細胞的自噬程度，p62是Keap1的調控蛋白之一，通過單獨調控keap1蛋白的活性來保證Nrf2的正常表達，當受到氧化刺激時，p62會通過自身的STGE位點與Keap1相結合，誘發keap1泛素化從而增加Nrf2含量。Liang等[13]證明黃芩苷可以增加p62表達，并提出黃芩苷可能通過增加p62表達的方式來激活Nrf2，并干擾Nrf2和Keap1間的聯系。Wang等[14]證明減少p62會降低keap1的自噬性泛素化程度，進一步證明了p62對keap1/Nrf2信號通路的調控作用。Matthew等[15]說明p62對keap1的抑制會進一步激活Nrf2，當Nrf2含量提高到一定程度，會導致自噬功能障礙，逆作用于選擇性自噬接頭蛋白（p62/Sequestosome 1，p62/SQSTM1），將其作為靶蛋白并降解。

4 Nrf2調控的下游抗氧化因子

4.1 Nrf2/HO-1

HO-1是一種重要的抗氧化酶，可以使得血紅素分解成CO、亞鐵和膽綠素。HO-1不僅可以通過分解血紅素來抑制其促氧化作用，分解產生的膽綠素可以有效清除ROS的活性[16]。研究發現，Nrf2/HO-1是心肌缺血-再灌注損傷保護的重要渠道，在缺氧/復氧條件下Nrf2/HO-1通路會被激活，心肌細胞由Nrf2機制產生3H-1、D3T誘導劑，并誘導HO/HO-1表達，從而幫助心肌細胞對抗氧化應激損傷[17-19]。Cheng等[20]證明了在心肌缺血再灌注的缺氧/復氧條件下，黃芩苷可以提高Nrf2/HO-1通路的表達。Yu[21]等進一步發現在缺血再灌注過程中，黃芩苷是通過上調Nrf2和HO-1的表達，來進一步激活Nrf2/HO-1信號通路。

4.2 Nrf2/NQO1

NQO1可以催化醌發生反應，防止醌被還原成半氫醌，半氫醌會反應產生ROS，因此NQO1通過對醌的反應處理來起到抗氧化劑的作用。Nrf2是穩態系統和氧化應激反應系統中控制NQO1的核心因子，Nrf2的含量與NQO1的表達程度呈正相關。Zhang等[22]證明黃芩苷可以上調Nrf2/NQO1/HO-1抗氧化信號通路，而NQO1是Nrf2調控下的產物。Chen等[23]證明黃芩苷可以減少Nrf2的含量，同時增加NQO1的mRNA轉錄活性。Yang等[24]通過熒光蛋白分析，證明黃芩苷可以顯著提高細胞內Nrf2水平，并能誘導NQO1含量的增高。

4.3 Nrf2/SOD

SOD的主要作用是清除超氧陰離子自由基，是生物體內清除自由基的首要物質，通過抑制細胞與氧反應中產生的超氧陰離子，催化其分解為過氧化氫和氧，間接幫助清除氧自由基[25]。黃賢華等[26]驗證了黃芩苷可以提高SOD活性，降低脂質過氧化反應的最終產物丙二醛（MDA）和髓過氧化物酶（MPO）的含量，清除氧自由基、減少脂質過氧化反應的發生。

4.4 Nrf2/CAT

CAT是細胞抗氧化的關鍵酶，可以分解過氧化氫，防止過氧化氫產生羥自由基，從而抑制脂質過氧化反應[27]。Zhu等人[17]研究證明，Nrf2與心肌細胞中CAT的誘導表達有關。KhanS等人[31]證明黃芩苷可以提高CAT的活性，減少活性氧（ROS）和MDA，抑制炎癥因子的表達。高善頌等人[4]證明黃芩苷可以通過激活keap1-Nrf2/ARE通路，提高抗氧化酶SOD的活性，進一步激活免疫調節系統，提高組織的抗氧化能力，抵抗氧化因素引起的損傷。

4.5 Nrf2/GSH

GSH與SOD、CAT一起作為氧化還原系統的核心抗氧化因子，具有清除自由基和防止過氧化反應損傷的作用。Nrf2可以提高γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamyl cysteine synthetase，γ-GCS）的表達，γ-GCS負責調控GSH的合成，因此Nrf2可以調控GSH的生物合成[17]。Nrf2還可以通過調節谷胱甘肽還原酶（Glutathione Reductase，GSR）來還原被胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）氧化的GSH，促進GSH的再生[29]。Chen等[30]證明黃芩苷通過降低肌肉過氧化脂質（Lipid Peroxidated Oxidation，LPO）、肌肉超氧陰離子和過氧亞硝酸鹽的產生，降低Nrf2的表達，增加GSH和GPx的表達，可以有效減輕骨關節炎（Osteoarthritis，OA）大鼠的氧化應激。

5 結語

本文簡述了黃芩苷的分子結構和基本特性，提出了黃芩苷調節下Nrf2的抗氧化機制，總結了其中起主要作用的上游調控因子和下游抗氧化因子，詳細說明了keap1、cul3和p62三種上游調控因子激活Nrf2的工作機制及Nrf2調節HO-1、NQO1、SOD、CAT和GSH等下游抗氧化因子的機理，為黃芩苷的臨床治療和藥物研提供了理論基礎。