強直性脊柱炎患者血小板微粒的促炎作用及其在臨床診治中的意義

孟磊 陳習超 侯麗瓊 陳雁飛

蘭州大學第一醫院，甘肅 蘭州730000

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病［1］，主要侵犯骶髂關節、脊柱骨突、脊柱旁軟組織及外周關節。AS 確切病因尚未完全明確，傳統的抗風濕藥物不能很好地控制病情進展，且藥物不良反應較大［2］。研究發現，AS 患者關節滑液中TNF-α 水平升高，使用TNF-α 拮抗劑可抑制AS患者的炎性因子水平［3］。血小板微粒（platelet microparticle，PMPs）可攜帶血小板激活產生的大量生物活性物質，是體內促炎癥分子的主要來源。研究表明，在類風濕關節炎患者的關節滑液中存在PMPs，導致關節滑液中的成纖維細胞激活，從而促進關節炎癥的發生［4］。目前國內外關于PMPs 與AS 相關性的報道較少，對于PMPs 在AS 發生機制及臨床治療中的作用缺乏相關研究。本研究通過比較AS 患者與健康對照組血漿PMPs含量的差異、AS 患者治療前后及不同治療方法之間PMPs 變化情況，探討PMPs 對AS 患者的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2018 年6 月至2019 年10 月于我院風濕免疫科收治確診的AS 患者59 例，入選標準符合美國風濕病學會1984 年修訂的AS 紐約分類標準［5］。排除標準：①合并心肌梗死者；②合并周圍血管栓塞性疾病者；③合并其他自身免疫疾病者；④腫瘤患者；⑤發病前2 周有炎性病變史或入院時發生感染性疾病者（如嚴重的上呼吸道感染、肺炎、高熱等）；⑥有嚴重肝腎功能不全者。同時納入健康對照組30 例，排除心、肝、肺、腦等器質性病變，無腦梗死、腦出血、炎癥、腫瘤、血液病和免疫性疾病，1 個月內無手術史，所有對象近2 周內均未應用過免疫抑制劑及抗血小板或抗凝藥物。本研究取得我院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。兩組一般資料差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 臨床資料。詳細記錄每例AS 患者及健康對照組的年齡、性別、BMI、魏氏法檢測血沉（ESR），速率散色比濁法檢測C 反應蛋白（CRP）。

1.2.2 藥物治療。所有AS 患者確診后開始治療。傳統方法治療組35 例，口服非甾體抗炎藥聯合柳氮磺吡啶（1.0g 2 次/日）；TNF-α 拮抗劑組24 例，使用注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白（25mg 2 次/周皮下注射）。治療3 個月后魏氏法檢測ESR，速率散色比濁法檢測CRP。

1.2.3 全血標本處理。取AS 患者治療前后及健康對照組清晨空腹靜脈血5mL，以枸櫞酸鈉抗凝，輕輕混勻后于180×g 離心10min，得到富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）；將PRP 移至離心管，2500×g 離心10min，上清液即乏血小板血漿（platelet poor plasma，PPP），凍存于-80℃冰箱。

1.2.4 PMPs 檢測。用抗原標記物CD42a+、CD42a+/CD31+標記PMPs，檢測采用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗CD42aIGg 單克隆抗體（購自BD 生物公司）與藻紅蛋白（PE）標記的抗CD31IGg 單克隆抗體（購自BD 生物公司），流式細胞術檢測CD42a、CD31 絕對數，結果用Flow jo 軟件分析。

1.3 觀察指標 比較兩組PMPs 及CRP、ESR 差異；TNF-α 拮抗劑治療與傳統方法治療前后PMPs 及CRP、ESR 差異。

1.4 統計學方法 使用SPSS18.0 軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，行正態性檢驗，AS 組與健康對照組間比較采用獨立樣本t檢驗，AS 治療前后比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者PMPs 及CRP、ESR 比較 與健康對照組比較，AS 患者CRP、PMPs、CD42a+、CD42a+/CD31+均明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者PMPs 及CRP、ESR 比較

2.2 不同方法治療前后PMPs 及CRP、ESR 比較 與治療前相比，兩種方法治療后PMPs 降低、CRP 下降，ESR 減慢，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。與傳統療法相比，TNF-α 拮抗劑治療后AS 患者PMPs、CRP、ESR 下降更明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 AS 患者治療前后PMPs 及CRP、ESR 比較

3 討論

AS 患者以男性居多且發病較早，男女發病比例約為2～3∶1，約80%患者30 歲之前發病，男性病情發展速度更快，癥狀更明顯［6，7］。AS 病變主要以中軸關節慢性炎癥為主，典型癥狀為骶髂關節炎，病變發展至晚期出現脊柱強直，呈“竹節”樣改變，關節外癥狀主要表現為急性葡萄膜炎與虹膜炎、主動脈關閉不全和傳導阻滯及腎臟淀粉樣變等。本病致殘率較高，嚴重影響患者的正常工作生活。CRP 是人類緊急情況下產生的一種與炎癥反應相關的非特異性急性反應蛋白，CRP 升高表明體內存在炎癥，且CRP 越高表明炎癥越嚴重［8］，CRP可作為AS 患者病情活動及臨床療效的評價指標之一。ESR 是一項實用的急性時相指標，可反映機體炎癥和組織損傷，ESR 升高程度與疾病嚴重程度呈正相關［9］。本研究中AS 組CRP、ESR 相較于健康對照組均明顯升高，提示AS 患者均有不同程度的炎癥反應。

AS 患者是以中軸關節無菌性炎癥為主要特征的慢性、進展性免疫炎性疾病。細胞因子是參與免疫炎癥反應的重要分子，T、B 淋巴細胞、巨噬細胞、滑膜成纖維細胞均參與炎癥的形成。PMPs 是活化或凋亡的血小板出芽脫落形成的一種超微囊泡結構，在電鏡下直徑介于100nm～1000nm 之間，占細胞微粒總數的70%～90%［10，11］。血小板膜上表達的40 多種糖蛋白及許多活化標志物大多可在PMPs 膜上表達，如GPIb、GPIa、GPIIa、GPIIb/IIIa、GPVI 及蛋白質二硫化物異構酶、趨化因子受體等。循環中PMPs 的含量反映了血小板的活化程度。PMPs 攜帶血小板激活產生的大量生物活性物質，而這些物質是體內促炎癥分子的主要來源。其中分化抗原CD40 配體（CD40L）可通過活化單核巨噬細胞分泌趨化因子，使巨噬細胞聚集，促進炎癥的發生，而循環中可溶性的CD40L 大部分來源于血小板及其微粒，因此，PMPs 具有顯著的促炎作用［12］。另外，體外凋亡產生的PMPs 可以與單核細胞結合，誘導其在纖維粘連蛋白表面黏附并向M2 亞型轉化，進而成為巨噬細胞發揮致炎作用［13］。本研究發現，AS 患者PMPs較健康對照組明顯升高，表明PMPs 可能通過其促炎作用參與AS 的發生及病情活動，與王鋒等［14］研究結論一致。而國外Ismail S 等［15］的研究結果發現，AS 患者組與健康對照組PMPs 濃度差異沒有統計學意義，但該研究納入病例僅限于男性，且均為輕度疾病活動的患者。因此，PMPs 與AS 的關系仍需進一步研究。

在過去的20～30 年間，盡管在減輕患者癥狀、減緩疾病發展等方面獲得一定進展，但尚不能完全阻止AS 的進行性關節融合，同時高額的治療費用給患者家庭帶來了沉重的負擔。對AS 患者的傳統治療主要以非甾體抗炎藥（NSAIDs）以及緩解病情抗風濕的藥物（DMARDs）為主。本研究AS 患者傳統方法治療組35例，口服NSAIDs 聯合柳氮磺吡啶（1.0g 2 次/日）3 個月取得了較好的效果，患者臨床癥狀緩解，CRP、ESR 及PMPs 較治療前均有所下降。臨床上AS 患者服用NASIDs治療后晨僵以及腰背疼痛等癥狀均有所緩解，患者活動范圍增加，關節腫脹減輕，但服用此類藥物后患者易出現胃腸不適以及肝腎功能受損等較多不良反應。目前最常用的DMARDs 類藥物為柳氮磺胺砒啶，該藥物對AS 患者的外周關節癥狀得到良好改善，但由于該藥物可引起患者消化系統不良反應、抑制造血系統的正常造血功能，部分患者甚至出現呼吸系統不良反應，影響生殖功能，難以耐受。

AS 可能與遺傳、感染、免疫功能紊亂及某些生物因子相關。研究表明，TNF-α、白介素、血管內皮生長因子（VEGF）家族等均與AS 的疾病活動相關，每個細胞因子均具有多效性，效應互相重疊協同［16］。已有的針對細胞因子的拮抗劑在AS 的治療中發揮了一定的作用［17］。TNF-α 主要由單核細胞、巨噬細胞、胸腺依賴淋巴細胞合成并分泌，主要功能為促進炎癥反應的發生、發展，調節自身免疫。AS 患者體內TNF-α 升高可促進炎癥瀑布反應，同時TNF-α 通過IG 對F-1、Osx 等因子的抑制作用而抑制成骨細胞分化，并刺激破骨形成，從而影響AS 患者的預后。現階段臨床上使用的TNF-α拮抗劑主要包括大分子抑制劑和小分子活性抑制劑。本研究24 例AS 患者接受抗TNF-α 生物治療，使用注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白。研究發現，AS 患者PMPs 及CRP 均明顯下降，血沉減慢，提示TNF-α 拮抗劑對于緩解AS 患者急性炎癥反應有顯著療效，尤其對癥狀顯著、CRP、ESR 提示嚴重炎癥反應的患者治療效果比NASIDs 及DMARDs 類藥物效果更佳［18］。長期慢性炎癥、免疫異常、骨破壞骨贅形成的過程會導致AS 患者體內TNF-α、IL-17 和IL-23 等炎癥因子大量產生，血小板、內皮細胞和淋巴細胞等活化或凋亡，在其活化或凋亡過程中，會促進PMPs 的釋放，表現為PMPs 表達升高［16］。本研究中兩種治療方法AS患者PMPs 與治療前相比均下降，但TNF-α 拮抗劑治療比傳統治療下降更加明顯，表明TNF-α 拮抗劑可能通過抑制TNF-α 的活性進而快速的減少PMPs 的釋放，降低PMPs 的表達。

綜上所述，本研究發現PMPs 可能在AS 炎癥的發生發展中具有重要作用，AS 患者外周血中PMPs 水平與炎癥指標密切相關，在一定程度上反映了體內炎癥水平，作為一種炎性指標對AS 患者診斷及治療均有重要的臨床意義，但是目前尚無法明確PMPs 影響AS發生及病情發展的具體機制，我們將在今后的工作中對這一問題進行深入研究。