紙基微流控數碼成像法快速測定金銀花中綠原酸含量

孔京華，樂 薇，于 敏，段鳳琪，耿 哲，劉詩詩，譚宋杰

(武漢工商學院 環境與生物工程學院，湖北 武漢 430065)

1 引言

綠原酸是一種非常重要的活性物質，現代科學對綠原酸的研究已經深入到食品、保健和日用化工等多個領域[1]。在衛生部《藥品標準》中，明確指出170種具有抗菌消炎、清熱解毒的中成藥均含有綠原酸且為主要成分[2]；在食品行業，綠原酸具有抗氧化穩定性和增香、保色等作用[3]，可廣泛應用于食品和果品保鮮；在日用化工行業現已有許多添加綠原酸的防曬護膚品[4]。

在綠原酸及其相關產品的研究及生產中，綠原酸的檢測是極其重要的環節。目前綠原酸的檢測方法多種多樣，如分光光度法、薄層層析—紫外分光光度法[5]、高效液相色譜法等方法，上述方法所需使用到的儀器昂貴且檢測所需耗材費用相對較高，對測定環境要求高且主要適合在實驗室進行檢測，不適于現場的快速檢測。基于這些因素限制了對綠原酸的進一步研究。目前國內外都在不斷探索綠原酸的提取和合成方法，其成果也非常顯著，這就對綠原酸的檢測手段和方法有了更高的要求。因此本研究提出一種新型綠原酸含量檢測方法—微流控紙芯片法。

微流控紙芯片法是當前微全分析系統發展的熱點，以紙張為制作材質的紙質微流控芯片(簡稱紙芯片)，是一種新型微尺度分析器件[6]。利用特定材質在紙上制作疏水邊界，將被測流體限定在預設的親水區域內，引導流體流入檢測區與預加的反應劑進行接觸反應。上述紙芯片有以下優點，分析速度極快，可在數秒或數十秒時間內自動完成測定、分離或其他更復雜的操作，分析和分離速度比常規宏觀分析法快一到兩個數量級；試樣與試劑消耗量極少，這既降低了分析費用和貴重生物試樣的消耗，也減少了環境污染，是綠色分析技術；便攜且應用廣泛[7]，由于將微通道網絡結構和其他功能單元集成在一個幾平方厘米的芯片上，因此易制成功能齊全的便攜式儀器，用于各類現場分析。

數碼成像比色法是基于數碼設備上獲得的顏色數值完成定量分析的一種新方法[8]。該方法利用數碼相機、智能手機等采集設備記錄與待測成分濃度直接相關的顏色并通過一定方式將顏色的深淺進行灰度值或RGB值等數值化進行表示[9]，具有簡便快捷、可進行現場快速定量測定的優勢。

因此本研究基于數碼成像法的原理，制作綠原酸快速測定紙芯片[10，11]，并結合智能手機的數碼成像功能[12]，開發的一種紙基微流控數碼成像法，為綠原酸含量快速測定提供新的思路。

2 材料與方法

2.1 材料

三氯化鐵(分析純) 天津市雙船化學試劑廠；綠原酸(標準品) 春秋制藥公司 ；甲醇(分析純) 天津市凱通化學試劑有限公司；石蠟(分析純) 中國石油天然氣股份有限公司；正庚烷(分析純) 天津市大茂化學試劑廠；金銀花(當季) 毫州市國藥中藥材飲片有限公司；定性濾紙(中速) 杭州通用電氣生物科技有限公司；所有實驗用試劑均為國產分析純。

2.2 儀器

40目篩 上虞市龍翔精密儀器廠；YP202N電子天平 上海精密科學儀器有限公司；四兩裝中藥材粉碎機浙江省瑞安市飛達藥材器械廠；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司； 0.1～2.5 μL移液器BIOHIT(百得)實驗室儀器有限公司；小米MI 9 SE智能手機小米科技有限責任公司；高效液相色譜儀 島津公司。

2.3 試驗方法

2.3.1 紙基微流控芯片的設計

疏水膠帶法制備紙基微流控芯片是取一定長度寬膠帶，在膠帶兩頭用膠帶固定在白色濾紙上，取一定大小的濾紙，用6 mm打孔器打孔獲得圓形濾紙，取6 mm的圓型濾紙每隔5 mm粘貼于膠帶上，以寬膠帶為疏水基底[13]，獲得陣列檢測紙芯片(圖1)。

圖1 疏水膠帶法紙基微流控芯片示意

2.3.2 紙芯片拍照取色

自制封閉式長方體白色泡沫拍攝箱(長：30.0 cm，寬：20.0 cm，高：23.7 cm，內鋪有A4白紙，手機攝像頭與紙芯片的位置距離為10 cm，光源與紙芯片的距離為3 cm)打開QQ軟件截圖功能，對所拍攝的照片進行RGB讀數，為保證數據的準確性，將顯色的濾紙平均分成四份。在四個區域分別讀數，取平均值。將得到的數據輸入EXCEL軟件中，按照數學模型計算[14]。

2.3.3 紙基微流控芯片法測定綠原酸含量的條件優化

對于所制作的紙基微流控芯片進行以下測定條件的優化。

2.3.3.1 氯化鐵溶液體積的影響

分別準確吸取0、0.5、1、1.5、2.0、2.5 μL4%三氯化鐵溶液滴于紙芯片的親水檢測區，以濾紙為背景進行拍照及取色。

2.3.3.2 氯化鐵溶液濃度的影響

分別吸取2 μL 2%、3%、4%、5%、6%的氯化鐵溶液在濾紙親水檢測區，待其干后，在檢測區上滴加40 mg/mL的綠原酸2.0 μL，同時吸取對應氯化鐵溶液于濾紙親水檢測區，作為空白對照。以濾紙為背景進行拍照及取色。

2.3.3.3 綠原酸溶液點樣體積的影響

分別吸取2.0 μL4%氯化鐵溶液滴于紙芯片的每個親水檢測區，待其干(約30 s)后，于檢測區依次準確滴加0、0.5、1、1.5、2.0、2.5 μL的40 mg/mL的綠原酸溶液，于室溫下反應5 min后，進行拍照及取色。

2.3.3.4 反應時間的影響

制作5個1×3的紙基微流控芯片，在膠帶上粘貼6 mm圓3個，在其中的一個圓上用記號筆標注序號1。在余下兩個圓濾紙上使用0～2.5 μL的移液槍，分別吸取4%氯化鐵試劑2 μL，待其干后。一個圓上滴加40 mg/mL的綠原酸標準溶液2.0 μL，另外一個不滴加任何試劑。將制作好的試紙粘貼在玻璃板上，分別在常溫下反應5、10、30、50、70 min后，以濾紙為背景進行拍照及取色[15]。

2.3.4 紙芯片法測定綠原酸含量的標準曲線建立

在長約15 cm的膠帶上每間隔0.5 cm粘貼直徑為6 mm的圓形濾紙一個，制備得到8×2的陣列檢測紙芯片。在最佳反應時間、顯色劑用量下，滴加配置好的不同濃度的綠原酸標準溶液，進行拍照及取色，分析其RGB值，代入建立的數學模型中，得到綠原酸含量的標準曲線。

2.3.5 金銀花中綠原酸的含量測定

2.3.5.1 綠原酸提取液的制備

取10 g干金銀花放入粉碎機中粉碎，過40目篩，提取，超聲過濾后將濾液定容至50 mL容量瓶。即得到綠原酸粗提[16]。

2.3.5.2 HPLC法-標準曲線法

色譜條件：色譜柱：Hypersil gold C18 (4.6 mm × 250 mm，5μm)，流動相：乙腈∶0.4%磷酸水溶液(85∶15)；檢測波長350 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃。精密量取2、4、6、8 mL 0.1 mg/mL綠原酸對照品溶液，用甲醇稀釋至10 mL，搖勻后得到不同濃度的綠原酸對照品溶液。各選10 μL進樣，以濃度為橫坐標，峰面積作為縱坐標，繪制標準曲線[17]。取提取的金銀花中綠原酸粗提液1 mL于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容。在相同色譜條件下，取10 μL進樣，將測得的吸收峰面積代入回歸方程計算其濃度，并計算金銀花中綠原酸的質量百分比。

2.3.5.3 紙芯片法-標準加入法

制備3×9陣列紙基微流控芯片[18]，在各親水檢測區按順序標注序號1-9。在1-9檢測區分別滴加2 μL4%的三氯化鐵溶液，在1-7號檢測區滴加上述制備的10、20、30、40、50 mg/mL綠原酸標準溶液2 μL。在8號檢測區滴加金銀花的綠原酸粗提液2 μL，9號檢測區作為空白對照，以濾紙為背景進行拍照及取色，平行實驗3次。取3次實驗的RGB平均值繪制標準曲線，計算綠原酸含量。

2.3.5.4 加標回收實驗

取待測樣品提取液1 mL至燒杯中，備用，在制作的3×9的紙基微流控芯片上滴加4%的三氯化鐵2 μL，再分別準確加入 0.1～0.5 μL的 40 mg/mL的綠原酸標準溶液，按照已優化的實驗條件進行顯色拍照及取色，平行三次實驗。

2.3.6 數據處理

按照回收率=(加標測定值-測定值)/加標量，計算本實驗方法的回收率[19]。

3 結果與分析

3.1 顯色條件的優化

3.1.1 氯化鐵體積的影響

不同氯化鐵體積對綠原酸檢測體系顯色的圖片及RGB值如圖2所示。在濾紙上可以看出，滴加0.5～1 μL時。黃顏色的三氯化鐵沒有完全覆蓋濾紙，在1.5 μL時剛好覆蓋，2、2.5 μL時完全覆蓋，為了保證氯化鐵在覆蓋濾紙且微過量。故選擇三氯化鐵溶液的滴加體積為2 μL。

圖2 氯化鐵體積的影響

3.1.2 氯化鐵濃度的影響

不同氯化鐵濃度對綠原酸檢測體系顯色的RGB值的影響如圖3所示。可知，隨著FeCl3的濃度增加，RGB值呈現下降趨勢。當氯化鐵溶液濃度從4%開始R、G、B值趨于穩定。由于氯化鐵溶液本身有顏色，過多的Fe3+存在RGB值減小，使靈敏度降低。綜合考慮，后續實驗選擇4%的氯化鐵溶液作為最佳反應濃度。

圖3 氯化鐵濃度的影響

3.1.3 綠原酸點樣體積的影響

不同綠原酸點樣體積下綠原酸檢測體系顯色的圖片及RGB值如圖4所示。從顯色圖上看，點樣體積為1.5 μL時，剛好鋪滿整個檢測區；從RGB值來看，點樣體積為2 μL時，RGB值趨于穩定；點樣體積大于2 μL時RGB值相對標準偏差較大，這是由于邊界顯色物質聚集使斑點顯色不均勻，造成R、G、B值重現性下降。綜合考慮，選擇點樣體積為2 μL。

圖4 綠原酸點樣體積的影響

3.1.4 反應時間的影響

在常溫下不同反應時間顯色圖片的RGB值如圖5所示。可以看出，該紙芯片反應4 min后R、G、B值趨于穩定，且在顯色10 min內其RGB保持穩定。本實驗選擇顯色時間為5 min。

圖5 反應時間的影響

3.1.5 標準曲線方程的建立

表1 不同數學模型的擬合情況

3.2 金銀花中綠原酸含量的測定

3.2.1 重復性實驗

按2.3.5操作，分別采用HPLC法測定綠原酸含量，平行3次，并與紙芯片法平行測定3次的結果進行比較，如表2所示HPLC法和紙芯片法。可知，HPLC法和紙芯片法重復性較好，RSD均不超過3%。此外從綠原酸含量的平均值來看，兩種測定方法的結果較接近，說明檢測結果完全能夠滿足綠原酸的檢測，且檢測結果較為準確、滿意。

表2 HPLC法和紙芯片法測定綠原酸含量的重復性實驗結果

3.2.2 金銀花的加標與回收

表3 金銀花的加標回收

3.3 HPLC法與紙芯片法的比較

本文對HPLC法和紙芯片進行了比較，結果如表4所示。可知，HPLC法具有檢測限更低、檢測儀器較昂貴的特點，而紙芯片法線性范圍更廣、檢測試劑體積極少、除智能手機外檢測材料可自制、成本更低廉，因此在一些檢測條件相對簡陋的快速測定中，紙基微流控數碼成像法更具優勢。

表4 HPLC法與紙芯片法的比較

4 結論

本實驗經過探究確定了三氯化鐵與綠原酸反應的最優條件，研究得到了檢測綠原酸的新方法。實驗結果表明，在4%的氯化鐵試劑與綠原酸在常溫下就能發生反應，并且在5 min之內顏色完成顯色反應，生成穩定的深綠色化合物，并且試紙顏色不會褪色[20]。之后用手機拍照后，對照片進行RGB值分析，通過建立的數學模型，即可得出待測液中綠原酸的濃度，且與HPLC法所測得的濃度相近。通過對金銀花中提取的綠原酸進行測定并與HPLC法測定結果對比發現，紙基微流控芯片的測定結果與HPLC法測定結果基本一致，能夠實現全定量測定綠原酸的濃度。綜上所述，所建立的紙基微流控數碼成像法快捷、價格低廉，檢測要求低，可廣泛應用于各種樣品綠原酸含量的快速測定。