水稻OsGRAS39基因的表達特征及基于CRISPR/Cas9技術的突變體創建

鄒 杰

(宜春學院 生命科學與資源環境學院,江西省作物生長發育調控重點實驗室,江西 宜春 336000)

GRAS蛋白家族是一類植物特有的轉錄因子家族,因最初包含GIBBERELLIN-INSENSITIVE(GAI)、REPRESSOR of ga1-3(RGA)和SCARECROW(SCR)3個成員而得名[1]。后來,Tian等[2]根據功能相似性和序列同源性,將當時在水稻和擬南芥中分別鑒定到的57，32個GRAS基因劃歸于8個亞家族,即:LISCL、PAT1、SCL3、DELLA、SCR、SHR、HAM和LS。迄今,已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)、番茄(Solanumlycopersicum)、棉花(Gossypiumhirsutum)、油菜(BrassicanapusL.)、紅薯(Ipomoeatrifida)等植物中對GRAS基因進行了全基因組水平的鑒定和分析[2-5],并發展出了新的基因亞家族[3-4, 6-8]。

研究表明,許多GRAS蛋白參與植物生長發育調控和激素信號轉導。在擬南芥中,SCR在根內皮層特異表達,對皮層/內皮層干細胞的不對稱分裂及根基本組織模式建成起重要調節作用[9]。3個GRAS轉錄因子SCR、SCARECROW-LIKE 23(SCL23)和SHORT-ROOT(SHR)在葉維管束鞘細胞的形成和外形的規整以及下胚軸內皮層(淀粉鞘)的形成中起著關鍵作用[10-11]。SCL3與DELLA相互抑制,維持正常的GA信號轉導通路[12]。在根的伸長/分化區,SCL3-DELLA互作調控GA信號通路,主要促使根內皮層細胞的伸長;在分生區,SCL3-DELLA對GA信號通路的調控還需要SHR/SCR通路的參與,調控內皮層的生成[13]。

此外,一些GRAS在植物對逆境脅迫的應激響應中發揮重要作用。胡楊PeSCL7在葉片中的表達受干旱和高鹽脅迫的誘導[14]。異源過表達PeSCL7能夠提高轉基因擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性[15]。玉米ZmSCL7的表達受NaCl、H2O2和低溫處理誘導,過表達ZmSCL7有助于提高煙草的抗鹽性[16]。獨行菜LaSCL18的表達受低溫脅迫的誘導,可能與其幼苗低溫耐受性有關[17]。Fode等[18]研究發現，擬南芥SCL14可以和Ⅱ類TGA蛋白結合形成復合物,參與激活植物自身的解毒系統以減輕有害化學物質對細胞的傷害。小麥TaSCL14則在光氧化脅迫響應中起重要作用[19]。鹽穗木HcSCL13的表達受鹽、干旱的誘導,異源過表達HcSCL13能促進轉基因擬南芥的生長并增強其耐鹽性[20]。

水稻中至少存在60個GRAS基因[3],目前僅DHD1、DLT、MOC1、MOC3、NSP1、NSP2、OsGRAS19、OsGRAS23、OsSHR2、SCR、和SLR1等少數幾個基因的功能被鑒定[21-30],其余大多數基因尚無功能研究的相關報道。OsGRAS39(LOC_Os10g22430.1)歸屬于PAT1亞家族[31-32]。為深入研究OsGRAS39的功能,本研究通過qRT-PCR技術分析了該基因在不同組織中、非生物逆境脅迫下及脫落酸(Abscisic acid, ABA)和赤霉素(Gibberellin A3, GA3)處理下的表達模式,并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術創建了該基因敲除的突變體,旨在為后續的OsGRAS39功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究轉基因受體材料為水稻粳稻品種日本晴(OryzasativaL.spp.japonicacv.Nipponbare)。

1.2 菌株、載體和試劑

本研究所用菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105由江西省作物生長發育調控重點實驗室保存。CRISPR/Cas9植物基因敲除試劑盒(pP1C.3 with DNA Recombinase)購于江蘇吉銳生物技術有限公司(中國南京)。高保真酶PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、微量DNA提取和PCR試劑盒MightyAmpTMGenotyping Kit、RNA提取試劑RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、qRT-PCR試劑盒TB Green?Premix DimerEraserTM均購于寶日醫生物技術(北京)有限公司。限制性內切酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。DNA Marker、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 水稻OsGRAS39表達模式分析

取三葉期水稻幼根和幼苗(地上部分)及生長至孕穗期的水稻的根、莖(穗下節間)、倒二葉的葉片、葉鞘和幼穗組織于液氮速凍后存于-80 ℃冰箱,用于部位表達分析。水稻種子萌發后于人工氣候箱(25 ℃,80% RH,光周期為L∶D=12 h∶12 h)培養至三葉一心期,分別進行高溫(42 ℃)、低溫(4 ℃)、高鹽(100 mmol/L NaCl)、模擬干旱(10% PEG6000)、ABA(100 μmol/L)和GA3(20 μmol/L)脅迫處理。在處理0,0.5,1,2,4,8,24 h取樣(取地上部分,每5株混合成一個樣品),液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

水稻總RNA用RNAiso Plus提取后,利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA。以水稻UBQ5(Os01g0328400)基因作為內參進行熒光定量PCR分析。使用TaKaRa試劑盒TB Green? Premix DimerEraserTM(Perfect Real Time),在賽默飛StepOnePlusTMReal-Time PCR System中進行qRT-PCR。qRT-PCR體系(20.0 μL):TB Green Premix DimerEraser(2×)10.0 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL、ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、cDNA 1.0 μL、補足滅菌ddH2O至20.0 μL。qRT-PCR反應程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環。試驗設置3個生物學重復,采用2-ΔΔCT法[33]計算基因相對表達量,使用SPSS 25.0軟件進行統計分析,采用Tukey法進行多重比較檢驗差異顯著性(P<0.05),使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

1.4 靶序列選擇及引物設計

利用CRISPR-GE網站(http://skl.scau.edu.cn/home/)[34],分析篩選OsGRAS39序列上sgRNA靶位點。選擇基因5′端處于外顯子區且潛在脫靶效應評分低的靶位點。然后根據基因敲除試劑盒的要求設計擴增sgRNA表達盒的引物U3p.3-F/Oligo-R(表1)。

1.5 CRISPR/Cas9表達載體構建

本研究采用江蘇吉銳生物技術有限公司的CRISPR/Cas9植物基因敲除試劑盒構建OsGRAS39的CRISPR/Cas9基因編輯表達載體。構建過程采用重組酶無縫克隆的方法進行。具體步驟:使用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR? Max DNA Polymerase,以pP1C.3載體為模板,用U3p.3-F/Oligo-R引物擴增sgRNA表達盒;反應體系參照高保真DNA聚合酶說明書;PCR產物經過凝膠電泳后切膠回收;使用限制性內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ將pP1C.3載體酶切線性化后通過凝膠電泳切膠回收;使用DNA重組酶將擴增獲得的sgRNA表達盒和線性化的pP1C.3載體重組,構建重組載體;參照試劑盒說明書配置反應體系,于37 ℃孵育30 min后迅速置于冰上15 min;將重組產物轉化大腸桿菌DH5α,37 ℃培養過夜;次日,隨機挑取培養皿上2個單克隆菌落搖菌,送生工生物工程(上海)股份有限公司通用引物M13F(-47)進行測序驗證;將測序正確的陽性克隆提取質粒,通過凍融法轉入農桿菌菌株EHA105中。

1.6 水稻遺傳轉化

水稻遺傳轉化參考Toki等[35]的方法,經過水稻胚性愈傷組織誘導,農桿菌侵染及共培養,抗性愈傷篩選,愈傷組織的分化和幼苗的生根及移栽等過程,完成水稻遺傳轉化。

1.7 突變體鑒定及突變類型分析

剪取T0轉基因植株幼苗大約2 mm2大小的葉片組織,使用試劑盒MightyAmpTMGenotyping Kit提取DNA。使用潮霉素抗性檢測引物Hyg-JF/Hyg-JR(表1)篩選轉基因陽性植株。在靶位點上下游設計1對突變體檢測引物C-GRAS39-JF/C-GRAS39-JR(表1),對轉基因陽性植株進行PCR擴增,PCR產物理論大小為499 bp。將PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結果用在線軟件工具DSDecodeM(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)[34]進行峰圖分析,以獲得基因突變信息。

表1 本研究所用引物

2 結果與分析

2.1 OsGRAS39基因的組織表達模式

本研究通過qRT-PCR的方法檢測了OsGRAS39在水稻不同組織中的表達情況。檢測結果顯示,OsGRAS39在所用組織中都有表達,其中在幼苗中的表達豐度最高,然后依次是幼根、葉片,在葉鞘、穗、根和莖中表達相對較弱(圖1)。

不同小寫字母表示差異達到顯著水平(P<0.05)。圖2同。

2.2 OsGRAS39逆境脅迫響應和激素應答

在不同的逆境脅迫和激素的處理下,OsGRAS39的表達受到不同程度的影響。在42 ℃高溫處理下,OsGRAS39的表達在處理的最初2 h內無顯著變化,在4 h后表達量顯著下調至初始表達量的40%以下(圖2-A)。OsGRAS39的表達受4℃低溫處理的誘導,在1 h其表達豐度即顯著上調至初始量的2.5倍左右,在2 h其表達強度約為初始水平的5.3倍,為最高值;隨后其表達水平逐漸回落,在24 h其表達水平與初始值相當(圖2-B)。OsGRAS39的表達受10% PEG6000處理的影響不大,其在所有處理時間點的表達水平無顯著差異(圖2-C)。在100 mmol/L NaCl處理下,OsGRAS39的表達從0.5 h開始即受到誘導顯著上調,上調的幅度大都在2～3倍(圖2-D)。在100 μmol/L ABA處理下,OsGRAS39的表達量在1 h顯著上調至初始值的1.9倍,隨后回復至初始水平,到8,24 h再次顯著上調(圖2-E)。OsGRAS39的表達在2 h開始受到20 μmol/L GA3的抑制,其表達量在8 h下調至最低點,大約為初始值的22%,但在24 h其表達水平顯著上調,約為初始值的1.9倍(圖2-F)。

圖2 OsGRAS39 在不同逆境脅迫下的表達模式

2.3 sgRNA靶點選擇和載體構建

本研究采用無縫克隆的方法將sgRNA表達盒克隆到CRISPR/Cas9載體pP1c.3上。pP1c.3載體的結構如圖3-A所示。水稻OsGRAS39基因結構只有一個外顯子序列,為了獲得CRISPR/Cas9誘導的定點突變導致的功能缺失型突變體植株,本研究利用在線設計網站CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/)[34]分析篩選sgRNA靶位點。最終基因編輯的靶位點選擇在反義鏈靠近起始密碼子ATG的第290位堿基到271位堿基處(圖3-B),靶點序列GC含量為65%。參照CRISPR/Cas9植物基因敲除試劑盒說明書上的方法,用引物U3p.3-F/Oligo-R擴增出sgRNA克隆框,通過重組酶作用與線性化的載體pP1C.3重組構建表達載體。重組載體經測序確認構建正確,命名為pP1C.3-OsGRAS39-gRNA。然后將質粒轉入到農桿菌EHA105中。

A.CRISPR/Cas9載體pP1C.3示意圖;B.OsGRAS39基因結構及sgRNA靶位點位置。

2.4 轉基因植株的獲得及突變類型分析

通過農桿菌介導的遺傳轉化,最終獲得30株轉基因苗(圖4)。PCR檢測結果顯示全部為潮霉素抗性的陽性苗(圖5)。通過測序和測序峰圖分析顯示,有8株在PAM附近發生了不同類型突變(圖6),包括1個純合突變體(#9),5個雙等位突變體(#6、#7、#26、#29和#30),以及2個雜合突變體(#3和#8)。在正常生長條件下,突變體與野生型的表型無明顯區別。

A.愈傷組織的誘導; B.愈傷組織與農桿菌共培養; C.愈傷組織的篩選; D.愈傷組織的分化培養; E.轉基因苗的生根。

M.Marker Ⅰ; P.pP1C.3-OsGRAS39-gRNA質粒對照;WT.野生型;1-30.轉基因植株。

WT.野生型; Ho.純合突變; Bi.雙等位突變;He.雜合突變;/.無突變;右邊數字表示堿基插入(+)或缺失(-)數。

3 結論與討論

研究發現,一些GRAS基因的表達存在組織特異性。例如,擬南芥SCR在根的內皮層特異表達,對皮層/內皮層的分化起決定作用[9];葡萄VvSCL14-like在休眠芽中特異表達[36]。而一些GRAS基因在植物各個組織中呈組成型表達。胡楊PeSCL7在根、莖、葉中均有表達[14];水稻DHD1[22]和OsGRAS23[26]在所有檢測的器官中表達,前者在葉片、葉鞘和穗中的表達較強,后者在根尖和穗中表達較強。Chen等[37]研究發現,OsGRAS19的表達在所有檢測的器官,包括根、莖稈、莖尖、葉片、葉鞘和花序中都檢測到,其在幼嫩器官中的表達豐度高于在成熟器官中的表達豐度。類似的,本研究中OsGRAS39在所有檢測的器官中都有表達且在幼苗中表達豐度最高,然后是幼根,這意味著OsGRAS39參與了水稻生長發育的整個過程,且在苗期的生長發育過程中的作用更大。但是,經CRISPR/Cas9定向編輯產生的OsGRAS39敲除突變體表型并未表現出與野生型明顯的差異,說明OsGRAS39在水稻生長發育方面的功能可能存在冗余。

本研究中,在各種逆境脅迫和激素處理下,OsGRAS39的表達受到不同程度的影響。其表達受低溫、高鹽和ABA的誘導,與山葡萄VaPAT1[38]的表達模式類似。與山葡萄VaPAT1[38]和番茄SlGRAS7[39]的表達被GA3持續抑制不同,本研究中OsGRAS39的表達在GA3處理2 h時開始下調,但在24 h表達上調。OsGRAS39的表達受低溫的誘導,與山葡萄VaPAT1[38]、茶樹CsCIGR[40]、番茄SlGLD1[41]和佛手CmsGRAS[42]相似。與本研究中PEG處理對OsGRAS39的表達無顯著影響不同,山葡萄VaPAT1[38]和茶樹CsCIGR[40]的表達受PEG的誘導,而鹽穗木HcSCL13[20]和番茄SlGRAS7[39]的表達也能被水分脅迫(分別為暴露于空氣中和甘露醇處理)誘導。與茶樹CsCIGR[40]的表達被高溫誘導相反,本研究中OsGRAS39的表達在高溫處理4 h后下調。綜上,OsGRAS39與同屬PAT1亞家族的CmsGRAS、CsCIGR、HcSCL13、SlGLD1、SlGRAS7和VaPAT1在不同逆境脅迫和激素處理下的表達模式既存在一定的相似之處也存在不同之處。研究表明,在擬南芥中過表達HcSCL13能提高轉基因植株的耐鹽性[20];過表達VaPAT1的擬南芥增強了對低溫、干旱和高鹽的抗性[38];過量表達SlGRAS7能提高番茄干旱和高鹽的耐受性[39]。鑒于OsGRAS39與HcSCL13、VaPAT1和SlGRAS7的表達模式存在不同程度的相似性,OsGRAS39可能在相應的逆境響應中發揮作用,這需要進一步的研究驗證。

本研究中OsGRAS39的突變類型包含了單堿基插入、缺失及長片段缺失。這幾種突變類型都存在移碼現象而使蛋白翻譯提前終止,說明成功獲得了OsGRAS39功能缺失的突變株。這些突變體的獲得,為進一步研究OsGRAS39在水稻生長發育過程和逆境脅迫響應中的功能提供了材料基礎。