利用同源重組構建BMP6、BMPR1B真核表達載體及共轉染成纖維細胞表達的研究

榮 恒,張夢瑤,賀建寧,柳 楠

(青島農業大學 動物科技學院,山東 青島 266109)

敖漢細毛羊是我國具有代表性的毛肉兼用細毛羊品種[1-2]。敖漢細毛羊是通過雜交培育得到的品種,它的父系和母系分別為前蘇聯美利奴羊和內蒙古當地的蒙古羊[3]。羊的毛囊能夠產生被毛,羊毛的產量也與毛囊息息相關[4]。因此,對于敖漢細毛羊來說,羊毛的品質尤為重要。現階段,它已有適應性強、體質結實繁殖率高、體格大等優勢[5],但還需要進一步提高凈毛產量,增加羊毛長度。因此,對于毛囊發育有關的基因的研究就很有必要。毛囊發育中起重要作用的有胰島素樣生長因子(IGF)家族、表皮生長因子(EGF)家族、轉化生長因子β(TGF-β)以及成纖維細胞生長因子(FGF)家族等[6-7]。

BMPs正是TGF-β家族中的成員,隸屬于TGF-β超家族[8],是一種具有分泌功能的蛋白,其成員有很多種[9]。有研究表明,BMPs對毛囊生長發育的作用主要表現為抑制[10],其表達量在毛囊發育的退行期最高并隨著毛囊的周期性生長發育呈現出周期性變化[11]。而BMPRs可與BMPs發生拮抗作用,間接促進毛囊的生長。毛青青[12]通過對小鼠的研究結果表明，BMP6基因是影響皮膚和毛囊發育的一個關鍵性基因。BMPR1B屬于BMPs家族的Ⅰ型受體成員[13],它受到BMPs家族的控制,BMPs的表達同時依賴于BMPRs類受體。BMPs和BMPRs在毛囊的發育過程中均起到一定的作用,前人已經對BMP6[14]和BMPR1B[15]的功能進行了研究,本研究在此基礎上,通過共轉染開展了兩基因相互作用研究,旨在為進一步的育種工作提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取40日齡的健康胎羊并及時消毒處理。

TRIzol(Roche)試劑、蛋白裂解液、EcoRⅠ限制性內切酶、KpnⅠ限制性內切酶、T4DNA連接酶、pcDNA3.1質粒、DH5α感受態細胞、DMEM(基礎培養基)、胰蛋白酶、標準胎牛血清、DPBS(磷酸緩沖鹽溶液)、Lipofectamine 2000、反轉錄試劑盒、SoSo試劑盒、切膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、培養皿等均購自青島尚賽科貿有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計在綿羊BMP6和BMPR1B基因序列(GenBank登錄號分別為XM_027958445.1和NM_001009431.1)CDS區外側設計引物并在上、下游引物的5′加入同源臂。BMP6基因完成后的引物序列:(F)5′-TTTAAACTTAAGCTTGGTACCATGATC CTGGTAACCGAATGCTG-3′;(R)5′-TGGATCCGAG CTCGGTACCTCAGCGGCACACATCCCTCCACTA-3′。BMPR1B基因完成后的引物序列:(F)5′-TTTAAAC TTAAGCTTGGTACCATGCTTTTGCGAAGTTCAGG-3′;(R)5′-TGGATCCGAGCTCGGTACCTCAGAGCTTAAT GCCTGGGACTCTGAC-3′。

PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳檢測,PCR體系(25 μL):DNA模板1 μL,上下游引物各1 μL,Green Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。

1.2.2 目的基因與表達載體同源重組 對表達載體pcDNA3.1進行EcoRⅠ單酶切,體系為:EcoRⅠ、KpnⅠ1 μL;pcDNA3.1 5 μL;Buffer 5 μL;ddH2O 39 μL。通過膠回收獲得較為純凈的目的基因以及pcDNA3.1,通過T4DNA連接酶將其連接。而后轉至DH5α感受態細胞后振蕩培養,提取陽性質粒。

1.2.3 成纖維細胞的培養 取40日齡胎羊組織置于培養皿中,用 75%的酒精清洗后再用含雙抗的PBS清洗。洗凈后將其剪成1.5 mm3左右,放入新皿中,加胎牛血清,置于培養箱CO2濃度5%、37 ℃條件下,4 h后加培養液。24 h后,用PBS沖洗后更換培養液,定時觀察。細胞生長到95%左右進行傳代培養。

1.2.4 細胞轉染 傳代后稀釋pcDNA3.1-BMP6、pcDNA3.1-BMPR1B和脂質體,需轉染pcDNA3.1-BMP6質量為6 030.41 ng,pcDNA3.1-BMPR1B質量為6 030.41 ng,培養液448.4 μL。脂質體取20 μL用培養液稀釋到500 μL。對照組,取培養液500 μL,脂質體取20 μL用培養液稀釋到500 μL。試驗組、對照組室溫各孵育10 min。將脂質體和pcDNA3.1-BMP6、pcDNA3.1-BMPR1B兩者進行混勻,室溫孵育20 min。將混合物加入到培養皿中,緩慢加入4 mL培養液(培養液不含血清不含雙抗)。在培養箱CO2濃度5%、37 ℃條件下,培養6 h后換液,繼續培養36 h。

1.2.5 細胞轉染后的RT-PCR 擴大培養轉染成功的單細胞,之后用TRIzol(Roche)試劑對轉染后的細胞進行RNA的提取并反轉錄成cDNA。通過PrimerPremier 5.0軟件設計BMP6、BMPR1B和GAPDH基因熒光定量PCR引物序列(表1)。

表1 qPCR引物信息

1.2.6 Western Blot 裂解并提取細胞中的蛋白質,電泳后對蛋白質進行PVDF轉膜2 h后封閉蛋白質2 h;TBST洗膜3次,每次5 min;稀釋一抗,用一抗孵育PVDF膜12 h;用TBST洗膜3次,每次5 min;稀釋二抗,孵育1.5 h;在暗室中曝光。條帶灰度值用Image J軟件分析。

2 結果與分析

2.1 目的基因擴增

圖1為PCR后凝膠電泳分析結果,擴增條帶單一明亮,大小分別位于537,1 509 bp處,與已知大小相符。

M.2000 Marker;1.BMP6基因擴增條帶(537 bp);2.BMPR1B基因擴增條帶(1 509 bp)。

2.2 pcDNA3.1載體單酶切及純化

酶切結果如圖2所示,pcDNA3.1載體為大小5 428 bp,圖中條帶與其大小所吻合,可用于后期的試驗。

M.10000 Marker;1.pcDNA3.1載體KpnⅠ單酶切;2.pcDNA3.1載體EcoRⅠ單酶切。

2.3 表達載體pcDNA3.1與目的片段重組及鑒定

菌液PCR電泳結果如圖3,擴增條帶單一明亮,位于537，1 509 bp處,分別為BMP6、BMPR1B基因。菌液測序后用Blast比對,經測序比對后堿基均未發生突變。提取重組質粒,如圖4所示,1，2為pcDNA3.1-BMP6重組質粒,大小為5 965 bp;3，4為pcDNA3.1-BMPR1B,大小為6 937 bp,與圖中條帶相符,成功構建重組質粒。

M.2000 Marker;1,2.BMP6菌液PCR;3,4.BMP1B菌液PCR。

M.10000 Marker;1,2.pcDNA3.1-BMP6重組質粒;3,4.pcDNA3.1-BMPR1B重組質粒。

2.4 細胞培養

細胞培養24 h后逐漸貼壁,組織塊的四周逐漸有細胞游出。傳代培養在細胞密度約為95%時進行,采用胰蛋白酶消化法,2 000 r/min的轉速下離心處理分離,成纖維細胞,之后擴大培養。觀察結果如圖5,6所示。

圖5 成纖維細胞原代培養(×100)

圖6 成纖維細胞傳代培養(×100)

2.5 實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達

對RT-PCR引物檢測結果如圖7所示,擴增條帶單一明亮,可進行后續RT-PCR。

M.500 Marker;1,2.GAPDH擴增條帶(A); M.500 Marker;1,2.BMP6擴增條帶;3,4.BMPR1B擴增條帶(B)。

圖8為實時熒光定量擴增曲線和溶解曲線,曲線清晰且峰值清晰單一,表明在實時熒光定量PCR過程中得到了特異性的擴增產物,可用來進行定量分析。經共轉染后,BMPR1B基因的表達量極顯著提高(P<0.01),BMP6基因無明顯變化(圖9)。

圖8 熔解曲線峰值圖和擴增曲線圖

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖12同。

2.6 Western Blot檢測蛋白的表達

Western Blot結果如圖10,其灰度值用Image J軟件分析灰度值。由圖11可知,經共轉染成纖維細胞后BMPR1B蛋白的表達極顯著高于單轉染組(P<0.01),BMP6蛋白的表達無明顯變化,與基因表達結果一致。

圖10 BMP6、BMPR1B蛋白條帶

圖11 BMP6、BMPR1B蛋白相對表達量

3 討論和結論

BMP6是BMP家族的一員[16]。文獻中已有相關研究,BMP家族在絨山羊毛囊發育的退行期表達量最高,在生長期其表達量會降低,隨著毛囊的周期性生長而呈現周期性變化[17],對毛囊的生長發育具一定的抑制作用。McMahon等[18]研究表明,Noggin基因對毛囊的發育具有一定的促進作用,其作用機制是基于抑制BMP基因家族的活性。相關研究證實,在敲除小鼠BMP6基因的受體BMPR1A后,小鼠的毛囊形態發生了改變,嚴重的甚至導致光禿[19]。而BMPR1B基因也屬于BMP信號通路中的一員,因此推測BMP6與BMPR1B這2個基因間可能存在基因的相互作用。對BMPR1B基因的研究就目前來說主要集中在動物的生殖、繁殖等方向。尤其是在排卵過程中有著重要作用,過表達BMPR1B基因的美利奴羊對卵巢顆粒細胞分化、卵泡發育、排卵等有很大影響[20],大大提高了排卵率。但對于BMPR1B基因在細毛羊毛囊中的研究還比較罕見,并且關于BMP6基因與BMPR1B基因間的相互作用目前尚未發現報道。因此,本試驗通過對pcDNA3.1-BMP6和pcDNA3.1-BMPR1B載體的構建并將其轉染至成纖維細胞,采用實時熒光定量PCR、Western Blot檢測其表達,研究兩基因間的相互作用,從細胞水平上驗證了兩基因間的互做以及對細毛羊毛囊的影響。

本研究通過對pcDNA3.1-BMP6、pcDNA3.1-BMPR1B的構建,測定轉染成纖維細胞后mRNA及蛋白的表達量。結果表明,共轉染成纖維細胞后BMPR1B基因的表達量極顯著升高且共轉染組的表達量極顯著高于單轉染組(P<0.01),BMP6共轉染組與單轉染組表達量近乎相同。由此推斷,BMP6基因可能會促進BMPR1B基因的表達,而BMPR1B對BMP6基因的表達幾乎沒有影響?？蔀檫M一步的分子育種工作提供依據。