山羊FGF18基因變異及其對羊絨性狀的影響

張瑞國,李少斌,王繼卿,劉 秀,羅玉柱

(甘肅農業大學 動物科學技術學院,甘肅省草食動物生物技術重點實驗室,甘肅 蘭州 730070)

成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factors, FGFs)是20世紀在大腦及垂體的組織提取物中發現的一種能促進成纖維細胞生長的活性物質[1],具有多種功能的信號蛋白,在生長發育、組織修復、脂肪代謝和器官形成中起著重要作用[2]。FGF18基因是FGF基因家族的一員,其編碼的蛋白質屬于分泌蛋白,在山羊上被定位于20號染色體,全長35 978 bp,含有5個外顯子,編碼207個氨基酸。FGF18通過與FGFs受體結合來進行信號傳導,其功能的發揮依賴于FGFs受體的時空表達[3]。

FGF18在骨的形成中起著關鍵作用[4],在這方面的研究已經成為熱點。進一步研究表明,FGF18在毛囊的發育和生長周期也起著重要的調控作用。吳瑜瑜[5]研究發現,在甘肅超細毛羊胎齡第87～108天,FGF18相對表達量逐漸升高,推測其在胎兒皮膚形成和發育過程中發揮了重要作用。在成年綿羊毛囊的生長旺盛期和緩慢期之間、頸部和腹部之間的FGF18基因表達量存在差異[6]。FGF18基因在小鼠角蛋白5-陽性角蛋白細胞中被有條件地敲除時,毛囊的靜止期會變得非常短,從而使毛囊生長周期明顯縮短,表明FGF18是調節毛囊靜止期的關鍵信號[7]。曹校瑞等[8]研究表明,FGF18信號可以促進小鼠毛囊從靜止期進入再生長期。

目前,有關FGF18基因多態性研究報道較少,并且集中在人類上。已有的研究表明,FGF18基因的遺傳多態性與中國漢族膝骨關節炎[9]和人類的非綜合征性唇腭裂[10]顯著相關,但其多態性對毛發影響方面的研究尚未見相關報道。毛發是毛囊生長發育的產物,凡影響毛囊生長發育的信號通路或基因都能間接地影響毛發的結構和生長[11]。鑒于FGF18基因對毛囊生長發育有重要影響,并且在山羊上尚未有FGF18基因多態性的研究報道,探討其變異及其對羊絨性狀的影響具有重要意義。研究結果將為豐富山羊基因組研究及其遺傳改良提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 血樣的采集

采集453只山羊血樣,其中隴東絨山羊(甘肅環縣)293只,柴達木絨山羊(青海漠河清牧場)110只,中衛山羊(甘肅景泰)50只。頸靜脈采血,肝素鈉(Heparin sodium)抗凝、-70 ℃保存。

1.2 羊絨性狀數據的測定

收集12月齡隴東絨山羊羊絨樣品,并收集記錄耳號、性別、胎次和父系等信息。抓絨后對羊絨進行稱質量得到產絨量;在山羊的體側部測量絨層高度;采用投影顯微鏡法,用CU纖維細度儀測定絨纖維直徑,測定工作在內蒙古農業大學動物科學學院生產與管理學實驗室完成。

1.3 DNA的提取

采用北京全式金的EasyPure?Blood Genomic DNA Kit試劑盒,按照其說明書提取山羊血液全基因組DNA。

1.4 引物的設計

參照GenBank中山羊FGF18基因組的序列(序列號NC_030827),應用Primer 5軟件設計3對引物分別擴增FGF18基因第3，4，5外顯子(表1),引物由華大基因公司合成。

表1 FGF18基因各個外顯子的引物序列

1.5 PCR擴增條件的建立

PCR反應總體積20 μL,上、下游引物(0.25 μmol/L)各0.8 μL,TaqDNA預混酶(南京諾唯贊生物技術有限公司)10 μL,dNTP 0.8 μL,ddH2O 7.6 μL。

PCR擴增程序:94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s,按各引物退火溫度退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 SSCP檢測與測序

取2 μL的PCR產物,加入8 μL變性上樣緩沖液(98%去離子甲酰胺,10 mmol/L EDTA,0.025%溴酚藍和0.025%二甲苯氰),105 ℃變性5 min后,立即置于冰水混合物中,上樣于14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=37.5∶1),在230 V,15 ℃,0.5×TBE的條件下電泳18 h。電泳結束后,將非變性聚丙烯酰胺凝膠進行銀染顯色[12],然后置于A4紙上判型。將初步判定為純合子樣品的PCR 擴增產物進行直接測序,序列測定由上海生工生物有限公司完成。

1.7 數據的統計與分析

用MEGA 5進行序列比對,利用 Popgen 32.0軟件計算有效等位基因數(Effective number of alleles, Ne)、遺傳雜合度(Heterozygosity, He)、遺傳純合度(Homozygosity, Ho)和等位基因頻率。采用 PIC 0.6 軟件計算群體多態信息含量(Polymorphism information content, PIC)。應用SPSS 19.0一般線性混合模型分析基因型對隴東絨山羊羊絨性狀的影響。研究發現,父系對所有羊絨性狀均有影響(P<0.05),所以作為隨機因素納入模型。性別對羊絨性狀有影響(P<0.05)或潛在影響(P<0.20),所以作為固定因素納入模型。分析模型如下:

Yijk=μ+Gi+Fj+Sk+eijk

式中,Yijk為個體性狀表型值,μ為群體均值,Gi為基因型效應,Fj為父系隨機效應,Sk為性別效應,eijk為隨機誤差,下標i,j和k為個體序號。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物的驗證

山羊FGF18基因各擴增區的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。引物P1、P2和P3的目的片段分別為267,177,345 bp,擴增產物與目的片段大小一致,且特異性較好,可做后續分析。

2.2 SSCP檢測與測序

山羊FGF18基因不同外顯子擴增區的SSCP檢測結果顯示,只在Exon 5區檢測到3種帶型,而在其Exon 3和Exon 4區只檢測到1種帶型(圖2),表明Exon 3和Exon 4區無多態性。在山羊FGF18的Exon 5區檢測到的3種帶型,對應3種基因型EE、FF和EF,由E和F 2個等位基因構成。

圖2 山羊FGF18 SSCP檢測

山羊FGF18基因的Exon 5區各基因型測序峰圖和等位基因的序列比對結果見圖3,4。結果顯示,在山羊FGF18基因蛋白質編碼區的498處堿基發生T→C的突變(c.498T>C)。氨基酸序列分析發現,該突變位點沒有引起氨基酸種類的變化,屬于同義突變。

標有方框的區域表示核苷酸序列突變的區域。

2.3 遺傳學分析

山羊FGF18基因 Exon 5的基因型頻率和等位基因頻率見表2。在3個山羊群體中,等位基因E均為優勢等位基因。基因型在3個群體中的分布略有差異,隴東絨山羊、柴達木絨山羊和中衛山羊的優勢基因型分別是EF(46.42%)、EE(54.50%)和EF(48.00%)。

標有下劃線處表示引物序列。

表2 FGF18基因Exon 5在3個山羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

隴東絨山羊、柴達木絨山羊和中衛山羊的FGF18基因的純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(Ne)和多態信息含量(PIC)等遺傳參數見表3。隴東絨山羊、柴達木絨山羊和中衛山羊的FGF18基因Exon 5區的PIC值都處于0.25～0.50,均表現為中度多態。經Hardy-Weinberg 平衡檢驗,FGF18基因Exon 5區在3個山羊群體中都處于Hardy-Weinberg 平衡(P> 0.05),說明FGF18基因Exon 5區在這3個山羊群體中都達到了遺傳平衡。

表3 FGF18基因在3個山羊品種中的遺傳多態參數和Hardy-Weinberg 平衡檢測

2.4 山羊FGF18不同基因型對隴東絨山羊羊絨性狀的影響

從表4可知,FF型山羊的產絨量和絨層高度顯著高于EE型和EF型山羊(P<0.05),EE型和EF型山羊的產絨量和絨層高度沒有顯著差異(P>0.05)。各基因型山羊的羊絨纖維直徑沒有顯著差異(P>0.05)。

表4 山羊FGF18基因的不同基因型對隴東絨山羊羊絨性狀的影響

3 討論與結論

FGFs家族關于毛發方面的研究越來越被重視,已經有許多成員被發現與毛發的生長有關,如FGF1、FGF2、FGF5、FGF7、FGF18、FGF20、FGF22等FGFs家族成員均被發現在皮膚和毛囊細胞中表達,參與皮膚再生和毛發生長的過程[13]。研究該家族成員在山羊中的表達調控、遺傳變異等分子生物學內容,具有重要的理論和實踐意義。

本研究首次研究了山羊FGF18基因第3，4，5外顯子的突變情況,結果顯示,在山羊3個擴增區域僅檢測到一個突變位點c.498T>C,表明該基因在這3個山羊品種中比較保守。有研究表明，FGF18的基因在進化過程中高度保守[14-15],核苷酸的變異程度較低,這與本試驗結果相一致。FGF18基因的保守可能與其功能有關,它參與了一系列重要的生命活動過程,如腦的發育、腺垂體的分化和增殖、骨骼生長發育和胚胎發育等[16]。本研究結果表明,FGF18基因c.498T>C位點在隴東絨山羊、柴達木絨山羊和中衛山羊中都符合Hardy-Weinberg平衡,說明經過了選擇和進化,該位點在3個群體中都達到了遺傳平衡。c.498T>C位點對應的3種基因型在這3個山羊品種的分布存在差異,造成這種差異的原因有很多,比如其選育史、生活環境和品種特性等。本研究發現,FGF18基因的變異能同時對產絨量和絨層高度產生顯著影響,這與絨層高度和產絨量之間表型相關[17]相一致,2個性狀的表型相關系數是0.490(0.3<|r| ≤ 0.7),呈中度的正相關[17],推測其變異可能通過影響其中一個性狀而對另一個性狀產生間接影響。目前,關于FGF18基因變異對毛絨性狀的研究未見報道,但有研究表明,FGF18基因能通過影響毛囊的周期來調節毛發的生長[8,13]。毛囊周期大致分為3個階段,生長期、退化期和靜止期[18],毛囊周期的變化會影響毛發的生長。Kawano等[13]把FGF18蛋白皮下注射到5只毛囊處于靜止期的小鼠中,發現有4只小鼠的毛囊開始生長,說明FGF18能促進毛囊從靜止期向再生長期的轉變。Vandenabeele等[19]研究發現，FGF18蛋白的表達量在患有季節周期性側面脫發的狗和正常狗中差異顯著,表明FGF18基因與毛發的生長相關。以上研究都說明FGF18基因對毛發的生長起到重要的調控作用,提示其變異能對毛絨的性狀產生一定影響。

雖然本研究在山羊FGF18外顯子中發現的c.498T>C位點是同義突變,沒有引起氨基酸的變化,但也可能對基因的功能產生影響。大量的研究結果表明,同義突變會從許多方面(基因剪接、mRNA穩定性、折疊和翻譯、蛋白質折疊和基于miRNA的表達調控等)影響基因的功能,與各種疾病存在一定的聯系[20]。FGF18對羊絨性狀的影響也可能是與FGF10等附近基因連鎖造成的。山羊的FGF10和FGF18基因都位于同一條染色體上,并且FGF10基因也能調控毛囊的周期[21]。

絨山羊產絨量、絨纖維直徑、絨層高度是衡量生產性能的3個重要指標。育種中,在絨纖維直徑保持不變的情況下,提高產絨量、增加絨層高度是十分必要的。產絨量是衡量山羊經濟價值的重要指標,在絨山羊的鑒定和選種中起到指導作用。絨層高度也是山羊重要的經濟性狀,與產絨量聯系緊密。在絨山羊生產中,產絨量和絨層高度提高是符合生產需求的。FF型山羊的產絨量和絨層高度均高于其他基因型山羊,提示若以這2個性狀為選育目標,應該提高群體中FF型山羊的比例。在3個山羊群體中,FF型山羊的比例均是最低的,說明山羊FGF18基因c.498T>C變異位點受人工選育的程度較低。

本研究在隴東絨山羊、柴達木絨山羊和中衛山羊的第3，4，5外顯子只檢測到了一個突變位點c.498T>C,該位點在這3個山羊群體中均呈中度多態,并且都符合Hardy-Weinberg平衡。在隴東絨山羊中,c.498T>C位點對產絨量和絨層高度影響顯著,提示若以這2個性狀為選育目標,FGF18基因可以作為分子改良的候選基因。