三疣梭子蟹JHEH基因的克隆及表達分析

鄭 亮,謝 熙,鄭宏坤,徐東杰,朱冬發

(寧波大學 海洋學院,浙江 寧波 315823)

保幼激素(Juvenile hormone,JH)是無脊椎動物生長發育過程中的一種重要激素,參與調控生長、性腺發育、變態等重要的生理過程[1]。血淋巴JH濃度變化受到其合成通路及降解途徑的調控[2]。保幼激素環氧化水解酶(Juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH)和保幼激素酯酶(JH esterases,JHE)是JH降解過程中的重要酶,它們分別水解JH的環氧結構和甲酯結構,最終生成無活性的保幼激素酸二醇(JH acid diol)[3]。

早期昆蟲JH降解活性的研究主要以JHE為主[4]。但不同研究也發現,JHEH在JH的降解代謝中同樣扮演了重要的角色[5-6]。與JHE相比,JHEH的重要作用表現在兩方面:① JHEH是一種非分泌酶,能在各發育階段的各個組織中降解保幼激素以調節其適宜濃度;② JHEH降解保幼激素生成的保幼激素二醇(JH diol)是一種不可逆的代謝產物,而通過JHE的降解產物保幼激素酸可以被重新利用合成保幼激素[7]。JHEH作用的重要性往往存在物種和時期特異性。例如在黑果蠅(Drosophilavirilis)中,JHE一直是其生命周期中主要的JH降解酶;而在同屬的黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中,其蛹期發育至成體這一過程中的JH降解則需要JHE和JHEH的共同參與,JHEH更是在成體期起著主要的JH降解作用[8]。JHEH基因目前已在家蠶(Bombyxmori)[9]、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)[10]、意蜂(Apismellifera)[11]等多種昆蟲中被克隆得到。JHEH的氨基酸序列均包含一個由天冬氨酸、組氨酸和谷氨酸(或者天冬氨酸)構成的保守催化三聯體結構,該結構是環氧化合物水解酶的核心結構域,能夠協助酶分子與底物的結合[12]。

近年來,JHEH的同源序列陸續在一些甲殼動物物種中被發掘[13-14]。這些JHEH序列與昆蟲JHEH具有較高的一致性,都含有保守的催化三聯體結構,表明了其具有催化環氧化物的潛在能力。但有意思的是,甲殼動物體內并沒有任何形式的JH,而是利用一種不含環氧結構的甲基法尼酯(Methyl farnesoate,MF)執行類似于JH的功能[15]。JHEH是否參與甲殼動物MF的降解代謝目前還缺乏定論。李真真[13]在日本沼蝦(Macrobrachiumnipponens)中擴增得到了JHEH基因的全長cDNA序列,并且組織表達顯示其在肝胰腺中表達水平最高。由于肝胰腺是MF降解代謝的主要組織,JHEH基因在肝胰腺的高表達被認為可能和MF降解有關。趙明等[14]在擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)中也報道了類似的結果,并發現JHEH基因在卵巢的未發育期到近成熟期表達較低,但在成熟期的肝胰腺和排卵后期的卵巢中則顯著升高,因此，認為JHEH可能參與卵巢發育的調控。

為了進一步明確JHEH在甲殼動物中的作用,本研究對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的JHEH基因全長cDNA進行了分子克隆,并分析了其在不同組織及卵巢發育和蛻皮過程中的表達水平變化。三疣梭子蟹是我國東南沿海一種重要的經濟蟹類。寧波大學甲殼動物發育生物學課題組在之前的研究中已經探明了蛻皮及卵巢發育過程中血淋巴MF的濃度變化[16-18]。通過比較分析JHEH基因表達與MF濃度水平的關系,本研究探討了JHEH在MF代謝通路中的可能作用,不僅為闡明JHEH的功能奠定了理論基礎,也將有助于完善甲殼動物蛻皮及卵巢發育的內分泌調控機制。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取健康的野生三疣梭子蟹,暫養在寧波市海洋與漁業研究院苗場實驗基地,每日投喂鮮活的蟶子。參照沈潔等[19]的方法,根據形態學的特征變化,將三疣梭子蟹蛻皮周期劃分為蛻皮后期(A、B期)、蛻皮間期(C期)、蛻皮前期(D0、D1、D2、D3和D4亞期)和蛻皮期(E期)共4個階段,采集蛻皮間期(甲寬13.3～16.7 cm,體質量180～240 g)的雌雄三疣梭子蟹的肝胰腺、卵巢、精巢、Y器、鰓、肌肉、腸、胸神經節、眼柄、腦、大顎器、表皮、心臟用于PtJHEH組織差異表達分析。再采集各蛻皮期三疣梭子蟹(E期除外)(甲寬8～12 cm、體質量42～83 g),取肝胰腺和Y器,用于分析PtJHEH在蛻皮周期中表達水平變化,每個蛻皮期分別取5只螃蟹作為生物學重復,采集的組織暫時轉移到RNA保護液(康為世紀)中,在-20 ℃中保存。根據性腺指數(GSI)和卵巢外部特征將三疣梭子蟹第2次卵巢發育劃分為4個階段,分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期[20],采集各個卵巢發育階段的三疣梭子蟹(甲寬14.2～17.3 cm;體質量170～350 g)的肝胰腺和Y器組織,用于第2次卵巢發育過程中PtJHEH表達水平的變化,采集的組織暫時轉移到RNA保護液中,在-20 ℃中保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉錄 將上述保存在RNA保護液中的樣品組織移到300 μL的TRIzol溶液(上海生工)中,按照TRIzol試劑盒說明書進行總RNA提取。總RNA經DNase Ⅰ(康為)去除基因組DNA后,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,并用超微量分光光度計Nanodrop 2000C(ThermoFisher)進行純度分析。用PrimerScript RT reagant Kit 試劑盒(康為)將總RNA進行反轉錄得到第一鏈cDNA,保存于-20 ℃。

1.2.2 全長cDNA克隆 根據轉錄組數據庫中JHEH的同源序列,設計特異性引物(表1),總體系為25 μL,擴增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,33個循環;72 ℃再延伸10 min,反應結束。PCR產物進行凝膠電泳后,根據DNA回收試劑盒(生工)說明書進行回收和純化。純化的DNA與pMD-18T載體(TaKaRa)連接后轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞(TaKaRa)中進行擴大培養。利用菌落PCR挑選陽性克隆,送至上海生工生物工程有限公司進行測序。根據測序結果,比對轉錄組序列,確定序列正確后,設計特異性引物(表1),利用RACE技術對3′和5′端的序列進行擴增。分別取1 μg肝胰腺總RNA,按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech)說明書對3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA進行合成。分別以上述cDNA為模板進行巢式PCR擴增,總體系為25 μL,擴增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,33個循環;72 ℃再延伸10 min,反應結束,PCR產物經瓊脂糖電泳確定后,按照上述步驟對其進行回收、純化、連接、轉化和測序。

1.2.3 生物信息學分析 測序結果利用Vector NTI 10.0對序列進行拼接,獲得三疣梭子蟹JHEH(PtJHEH)的全長cDNA序列,利用NCBI ORF Finder 在線工具確定PtJHEH的開放閱讀框ORF序列,并翻譯成氨基酸序列。利用ProParam tool分析預測氨基酸基本理化性質;使用Signal 5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/service/SignalP/)分析蛋白質信號肽;利用在線TMHMM工具預測氨基酸跨膜區域,使用SMART程序分析氨基酸結構。采用在線工具Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對蛋白質三級結構預測;利用Expasy(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)對蛋白質的疏水性/親水性進行預測;利用NCBI BlastP在線搜索不同物種的同源序列,使用ClustalX軟件進行多重序列比對;挑選具有代表性的物種的JHEH氨基酸序列,使用MEGA 5.0 軟件的鄰近法(Neighbor-Joining)構建系統進化樹。

1.2.4 實時熒光定量(RT-qPCR) 根據已經獲得PtJHEH基因的cDNA全長序列設計一對特異性引物PtJHEH-q-F和PtJHEH-q-R(表1),以β-actin-F和β-actin-R(表1)作為內參引物利用qPCR對PtJHEH基因進行表達水平分析。擴增條件為:95 ℃ 2 min;95 ℃ 5 s,58 ℃ 20 s,68 ℃ 20 s,共40個循環;95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,升溫25 min,95 ℃ 15 s。各樣品中目的基因的相對表達量用2-ΔΔCt法進行計算,以其中一個樣品中的表達水平為參照,其他樣品中的表達水平則以其倍數表示。

表1 PtJHEH擴增及表達所用引物

1.2.5 數據分析 結果用“均值±標準差”表示,利用Statistical Product and Service Solutions(SPSS)20.0軟件對數據的統計學顯著性進行分析。結果首先用Kolmogorov-Smirnov and Cochran對其方差齊性進行檢驗,若方差不齊,則用Mann-Whitney非參數檢驗法分析;若方差整齊,則用Duncan或t檢驗法分析。分析結果P<0.05表示顯著性差異,用不同字母表示。

2 結果與分析

2.1 三疣梭子蟹JHEH基因的克隆及蛋白的結構分析

使用引物PtJHEH-F和PtJHEH-R得到的產物,經過測序顯示該片段長度為1 374 bp(圖1-A),用引物PtJHEH-3′F1和PtJHEH-3′F2進行3′-RACE得到的產物,經過測序顯示該片段長度為108 bp(圖1-B)。用PtJHEH-5′R1和Outer primer引物先進行第1輪PCR擴增,再以該PCR產物為模板,用PtJHEH-5′R2和Inner primer 引物進行第2輪PCR擴增,得到5′-RACE的產物,測序結果顯示該片段為321 bp(圖1-C)。將測序得到的序列進行拼接,結果得到長度為1 803 bp(圖2),該序列GenBank登錄號為KU216465,該基因的5′非編碼區為321 bp,3′非編碼區為108 bp,開放閱讀框(ORF)為1 374 bp,編碼467個氨基酸。

從左到右的DNA Marker分別是DL2000、DL500和DL1000。

ORF用大寫表示;信號肽用下劃線標出;保守特征位點用灰色背景標出;起始密碼用方框框出;星號表示終止密碼。

生物信息學分析顯示,PtJHEH分子式為C2367H3624N614O634S13,分子質量為51.24 ku,等電點(pI)為8.58,不穩定系數為35.63,含有負電荷氨基酸殘基42個,正電荷氨基酸殘基45個。利用SignalP對編碼區進行分析,發現三疣梭子蟹JHEH有25個氨基酸殘基的信號肽(圖3-A),表明三疣梭子蟹JHEH屬于分泌蛋白。使用TMHMM工具分析發現該氨基酸序列具有跨膜結構(圖3-B),跨膜結構域位于第20-37個氨基酸的位置。預測PtJHEH的三級結構(圖3-C)發現,PtJHEH中包括α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規則卷曲。對PtJHEH氨基酸序列的親水性/疏水性進行預測(圖3-D)發現,PtJHEH氨基酸序列中的親水性氨基酸占比要高于疏水性氨基酸,故PtJHEH為親水性蛋白。

A.蛋白質信號肽預測;B.蛋白質跨膜區預測;C.蛋白質三級結構預測;D.蛋白質親水性/疏水性預測。

2.2 三疣梭子蟹JHEH氨基酸多序列比對及系統進化樹分析

選取擬穴青蟹(SpJHEH)、羅氏沼蝦(MrJHEH)和凡納濱對蝦(LvJHEH),還有具有代表性的昆蟲中的家蠶(BmJHEH)和黑腹果蠅(DmJHEH)的氨基酸序列與三疣梭子蟹JHEH氨基酸序列進行多重序列比對分析(圖4),結果顯示，氨基酸序列共同包括N-末端的膜錨定位點“XWG”、催化三聯體結構(Asp225、Glu404和His431)、酪氨酸殘基(Tyr297和Tyr375)和“HGWP”花樣結構,PtJHEH與其他物種的JHEH都具有典型的環氧化酶催化結構域。

劃線部分表示信號肽；方框里的是保守特征位點；三角形代表N-末端的膜錨定位點“XWG”。

利用MEGA 5.0軟件,將PtJHEH的氨基酸序列與其他物種的JHEH氨基酸序列通過鄰近法構建系統進化樹(圖5),結果顯示，三疣梭子蟹JHEH與甲殼動物的擬穴青蟹JHEH最為接近,其同源性為90.83%,其次是與羅氏沼蝦的同源性為67.46%,與凡納濱對蝦的同源性為61.39%。三疣梭子蟹JHEH與其他甲殼類動物的JHEH聚為一支,與其傳統的分類地位相吻合,說明PtJHEH氨基酸序列在進化上保守性強。

圖5 三疣梭子蟹JHEH氨基酸序列系統進化樹

2.3 PtJHEH在三疣梭子蟹不同組織中的表達差異

實時熒光定量結果顯示,PtJHEH在雌雄各組織中均有不同程度的表達(圖6),其中表達量最高的組織是肝胰腺,與其他組織有顯著性的差異,其次是Y器。

IN.腸;TG.胸神經節;HP.肝胰腺;HT.心臟;BR.腦;MS.肌肉;ES.眼柄;YO.Y器;MO.大顎器;EP.皮;OV.卵巢;TE.精巢;GI.鰓。不同字母表示雌雄組內的不同組織之間的表達水平差異顯著(P<0.05)。

2.4 PtJHEH在蛻皮周期中的表達水平變化

鑒于PtJHEH在雌雄蟹肝胰腺和Y器中表達量均是最高,選取三疣梭子蟹肝胰腺和Y器作為試驗材料研究PtJHEH在蛻皮周期中的表達變化。結果顯示(圖7):肝胰腺中PtJHEH在各個時期均有表達,從蛻皮后期(A和B)至蛻皮前期D0亞期,呈現出逐漸下降的趨勢,在D0期降到最低,之后從D0期開始逐漸上升,至D2期升至最大,之后迅速回落,保持較低的表達水平;Y器中PtJHEH從蛻皮間期(C)至蛻皮前期D4亞期的相對表達量一直較低,而蛻皮后期中的A期至B期呈現上升趨勢,在B期升至最大,并與其他時期相比具有顯著性差異。

不同字母表示蛻皮周期各期表達水平有顯著性差異(P<0.05)。

2.5 PtJHEH在第2次卵巢發育階段中的表達水平變化

實時熒光定量結果顯示(圖8),在三疣梭子蟹第2次卵巢發育過程中,肝胰腺中PtJHEH的表達水平變化在Ⅰ期和Ⅱ期表達量較低,在Ⅱ期有略微下降,至Ⅲ期表達量顯著增大(P<0.05),之后Ⅳ期略有下降。Y器中PtJHEH的表達水平變化在Ⅰ期至Ⅲ期呈現出上升趨勢,Ⅲ期升至最大,之后Ⅳ期迅速回落。

不同字母表示卵巢發育不同發育期之間表達水平有顯著性差異(P<0.05)。

3 結論與討論

本研究克隆得到了PtJHEH的全長cDNA序列,該序列全長1 803 bp,包括1 374 bp的開放閱讀框、321 bp的5′端非編碼區和108 bp的3′端非編碼區,編碼467個氨基酸。通過對三疣梭子蟹JHEH氨基酸序列與近源物種同源性的結果分析發現,該序列具有JHEH所有的結構域特征,包括催化三聯體(Asp225、Glu404和His431)、構成陰離子的殘基(Tyr297和Tyr375)和“HGWP”花樣結構。這表明PtJHEH是一個典型的環氧化合物水解酶,具有催化活性。另外,在N末端有高度保守的“XWG”固定位點,在家蠶中被認為是亞細胞定位的膜錨著點。但是在真菌、細菌和原生動物中不存在[21]。進化樹分析發現,三疣梭子蟹JHEH與其他甲殼動物的JHEH親緣關系較近,符合其傳統的分類地位。

組織表達結果顯示,PtJHEH在肝胰腺中的表達水平最高,與日本沼蝦[13]和擬穴青蟹[14]的結果一致。肝胰腺是MF代謝的主要組織,MF酯酶的酶活及基因表達都在肝胰腺中最高[22-23]。然而,JHEH的高表達是否與MF有關還需要進一步證實。事實上,在意蜂(Apismellifera)中,JHEH并無JH降解活性,但是卻在脂肪代謝中發揮作用[11]。肝胰腺是甲殼動物物質代謝的主要場所[24],JHEH在肝胰腺中的高表達也可能與其參與其他物質的代謝過程有關。除肝胰腺外,PtJHEH在Y器中也有較高表達。Y器是甲殼動物產生蛻皮激素的主要位點,而蛻皮激素的合成又可能受到MF的調控[25]。由于JHEH是一種非分泌酶,如果JHEH存在對MF的調控作用,其可能在Y器中表達控制細胞中MF的含量,以確保合適的蛻皮激素合成速率。

為了進一步明確JHEH與MF的關系,檢測了蛻皮周期及卵巢發育過程肝胰腺和Y器里PtJHEH的表達水平變化。在蛻皮周期中,肝胰腺中PtJHEH的表達變化與之前報道的血淋巴MF濃度及其合成酶基因表達的變化在蛻皮前期存在一定相關性,后兩者均在蛻皮前期D1亞期[26],略早于PtJHEH表達的高峰。這說明PtJHEH可能響應MF進行表達,以調控機體正常的MF濃度。但在蛻皮后期(A和B),血淋巴MF濃度及其合成酶基因的表達都處于較低水平,而PtJHEH卻保持了穩定的表達,說明PtJHEH可能有MF之外的作用對象。而在Y器中,PtJHEH在A和B期顯著高表達,也與此時較低的血淋巴MF濃度[25]和蛻皮激素濃度保持一致[27]。

在卵巢發育過程中,肝胰腺和Y器里PtJHEH的表達水平變化較為一致,均是在前卵黃合成期(Ⅰ期)和卵黃合成早期(Ⅱ期)較低,而在卵黃合成晚期(Ⅲ期)和成熟期(Ⅳ期)顯著上升。該變化趨勢與擬穴青蟹報道的JHEH在卵巢發育過程中的表達變化相似[14],也和已報道的卵巢發育過程中血淋巴MF濃度[25]和蛻皮激素的濃度[28]保持了一致。這個結果也再一次表明了JHEH可能參與MF濃度的調控。值得注意的是,MF并沒有環氧結構,JHEH對MF無法產生直接的催化降解作用,因此，可能還存在其他的調控機制實現JHEH與MF的聯系。近年來,在一些甲殼動物物種中發現了昆蟲MF的環氧化酶CYP15A1的存在,本課題組近期在研究三疣梭子蟹CYP15A1時也發現其在肝胰腺、卵巢、Y器等組織中均有表達。因此,MF極有可能在這些器官中進一步被環氧化成JH,進而被JHEH催化降解。

總之,本研究對三疣梭子蟹JHEH基因的全長cDNA進行了分子克隆并分析了其在不同組織及卵巢發育和蛻皮過程中的表達水平變化。通過比較分析蛻皮及卵巢發育過程中JHEH基因表達模式與MF濃度變化的關系,本研究探討了JHEH在MF代謝通路中的可能作用,為今后闡明JHEH的功能奠定了理論基礎,也有助于進一步完善甲殼動物蛻皮及卵巢發育的內分泌調控機制。