水稻抗白葉枯病近等基因系的抗性鑒定揭示基因聚合的多向性效應

周俊飛,章 山,孫 婧,張 偉,高利芬

(江漢大學 系統生物學研究院,湖北 武漢 430056)

水稻白葉枯病是由革蘭氏陰性菌黃單孢菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)侵染引起的一類細菌性維管束病害,是對水稻產量最具破壞性的病害之一。利用抗病基因培育抗病品種是控制白葉枯病最經濟有效的手段[1]。目前,已經鑒定了將近40個白葉枯病抗性基因,9個(Xa1[2]、Xa3/Xa26[3]、xa5[4-5]、Xa10[6]、xa13[7]、Xa21[8]、Xa23[9]、xa25[10]和Xa27[11])已經被克隆。只有7個抗病基因Xa21、xa5、Xa7、Xa10、Xa27、Xa23和Xa27相應的無毒基因(avr基因)被分離。有意思的是,其中的5個avr基因(avrxa5、avrXa7、avrXa10[6]、avrXa23[12]和avrXa27[11])都屬于TAL效應子(Effector),它是由黃單胞菌通過細菌Ⅲ型分泌系統分泌的一類細菌蛋白質,作為轉錄因子,通過結合目標基因的啟動子區來激活植物基因的表達[13]。由于水稻宿主和致病菌的協同進化,在植物抗病基因與病原菌avr基因的互作壓力下,病原菌通過偽裝、多樣化avr基因或獲得額外的效應子來避免相應的抗病基因的識別,從而使得單個抗病基因提供的抗性很容易被克服[14]。例如,Xa4大面積長期應用后,導致白葉枯菌小種進化,抗病品種已經喪失了抗性[15];xa5對含有TAL效應基因pthXo1的菌株無效[16];P6小種不能感染攜帶Xa21的抗病品種,但是在P6的raxX基因缺失或raxST基因突變后能夠克服Xa21介導的抗病反應[17]。

基因聚合是培育具有持久和廣譜抗性等優良性狀后代的有效策略。例如Xa21+xa13的聚合系抗性明顯高于僅含有一個抗病基因的水稻[18]。Xa7和Xa21[19],Xa21、Xa4和Xa23[20],xa5、xa13和Xa21[21]等白葉枯抗病基因累加后,抗性增加,抗譜拓寬。不僅如此,白葉枯病抗性基因與其他基因聚合后,可增加對其他病蟲害的額外抗性。例如含Xa23與稻瘟病抗病基因的基因聚合水稻系同時獲得了對白葉枯病和稻瘟病的抗性[22]。含Xa23與細菌性條斑病抗性基因Rxol的基因聚合水稻系同時抗白葉枯病和細菌性條斑病[23]。Xa21、Bt基因與幾丁質酶基因的三基因聚合系IR72則同時抗白葉枯病、紋枯病和蟲害[24]。抗病基因組合后呈現正向的抗性累加效應是育種家所期望的,然而,并非所有的抗病基因組合都能獲得正向的抗性疊加效應。比如,Xa27介導的抗性在xa5和Xa27雙基因純合系中大大減弱[25];同樣,在xa5和Xa10雙基因純合植株中,依賴于avrXa10的Xa10的表達和Xa10介導的對PXO99A的抗性都被部分抑制[6];在xa5和Xa23雙基因純合植株中,avrXa23誘導的Xa23表達完全喪失,Xa23介導的抗性水平也降低[26]。

通過分子標記輔助回交選育的含單抗病基因和基因組合的近等基因系(NILs),為研究抗病基因的功能提供了珍貴的材料。前期研究中,揭示了xa5和Xa21單基因抗病系和基因累加系的抗性正向疊加效應,本研究繼續報道了xa3、Xa23單基因抗病系以及xa5、Xa4、Xa21和xa13等基因聚合系的抗譜。通過比較分析8個致病菌對這些抗病系的致病性,揭示了單個抗病基因和基因組合后的抗病效應的不確定性以及致病菌的毒性變異。研究結果為水稻抗病系培育和水稻種植布局提供了理論基礎。

1 材料和方法

1.1 水稻材料

本研究所用的水稻材料包括對白葉枯菌敏感的粳稻品種TP309和秈稻品種IR24,單基因抗病系IRBB3、IRBB5、IRBB21、CBB23,多抗病基因聚合系IRBB50、IRBB54和IRBB59。所有IR系列水稻的遺傳背景都是IR24。IRBB3、IRBB5、IRBB21是分別含Xa3、xa5和Xa21的單抗病基因近等基因系[27];IRBB50、IRBB54和IRBB59是分別含Xa4+xa5、Xa21+xa5、Xa21+xa5+xa13基因組合的多抗病基因近等基因系[28-29]。CBB23是以感病秈稻品種JG30為輪回親本,通過5代回交選育的攜帶Xa23基因的單抗病基因系[30]。

1.2 革蘭氏陰性菌黃單孢菌的培養和水稻抗譜鑒定

將江漢大學保存的8個來自菲律賓的白葉枯菌小種(P1:PXO61、P2:PXO86、P3:PXO79、P4:PXO7、P6:PXO99、P7:PXO145、P8:PXO280和P10:PXO124)在PSA培養基(土豆300 g/L、蔗糖 15 g/L、Na2HPO4·12H2O 2 g/L、Ca(NO3)2·4H2O 0.5 g/L、瓊脂15 g/L)上活化,刮取活化后的菌斑用無菌水制備成濃度約為109個細胞/mL的菌液用于水稻品種的抗性鑒定。在水稻生長的高分蘗期,用剪葉法[31]進行接種。每個小種接種5株,每株接種3～5個葉片。接種12 d后,對病斑長度進行測量,每個小種至少測量10個葉片。病斑長度用于評價抗病系的抗性水平,根據標準病害分級系統,病斑長度≤3 cm表示抗病(R),3～6 cm 表示中度抗病(MR),6～10 cm表示中度感病(MS),≥10 cm 表示感病(S)[32]。

1.3 抗性基因的分子標記檢測

為了確保所種植的抗病系含有相應的抗病基因,對抗病系IRBB3、IRBB5、IRBB21、IRBB50、IRBB54和IRBB59所含有的抗病基因進行了分子標記輔助檢測。對xa5的檢測采用的是CAPS標記xa5-XhoⅠ F/R[33],Xa21使用的是Gao等[34]開發的一個功能標記U1/I2,Xa3使用的是功能標記BB3-RF/R[35],特異的在抗性材料里擴增;Xa4使用的是緊密連鎖的SSR標記RM224[36],Xa23使用的是共分離標記Lj74[37]。具體的引物序列和預期的PCR產物長度見表1。

表1 抗病基因分子標記檢測引物

2 結果與分析

2.1 接種試驗檢測8個小種的有效致病性

為了保證接種的有效性,在進行接菌試驗時,對不含有以上抗病基因的受體品種IR24和另外一個感病粳稻品種TP309同時進行了接種。IR24的接種結果在之前的研究中已經報道[34]。IR24對8個小種都表現出明顯的感病表型,其中被P8感染后的葉片病斑長度最長,有20～25 cm,而P6的病斑長度最短,僅有3～6 cm(圖1-B和文獻[34]的表1,S1)。TP309在受到8個小種侵染后,被P8侵染后的葉片病斑最長,平均長約19 cm,被P6侵染后的葉片病斑長度最短(圖1)。對TP309和IR24的接種結果表明,8個小種都具備致病性,且P8小種的致病力最強,這8個小種可以用于抗性品種的抗譜分析。

A.8個小種在TP309上致病的圖像;B.8個小種在TP309和IR24上誘導的病斑長度。P1-P10.Xoo 小種。

2.2 分子標記輔助檢測抗病系的真實性

采用xa5-XhoⅠ F/R、U1/I2、BB3-RF/RR、RM224和Lj74引物,分別對單基因系和聚合基因系中的xa5、Xa21、Xa3、Xa4和Xa23進行分子標記檢測。檢測結果如圖2所示,以不含目標抗病基因的IR24為對照,IRBB3中能檢測到Xa3基因,IRBB5、IRBB50、IRBB54和IRBB59均能檢測到xa5基因,IRBB50中能檢測到Xa4基因,IRBB21、IRBB54和IRBB59中均能檢測到Xa21基因;而以不含Xa23基因的C418為對照,CBB23中能檢測到Xa23基因。分子標記的檢測結果證明了試驗材料的真實可靠。

CK.雙蒸水為模板。IR24、C418.陰性對照;IRBB3、IRBB5、IRBB21、CBB23、IRBB50、IRBB54和IRBB59.抗病近等基因系。

2.3 單基因抗譜揭示病原菌毒性變異

在前期的研究中,報道了xa5和Xa21基因對8個小種的抗性,xa5對所有8個小種表現出抗性,而Xa21對P2、P3、P4和P6表現出抗性,對P1、P7和P10中度感病,對P8則完全敏感[34]。本研究中,進一步報道了Xa3和Xa23單基因抗病系的抗譜。結果如圖3所示,單基因抗病系中,IRBB3的整體抗性最弱,對P1、P2、P3、P4、P6和P10中度感病,對P7和P8完全感病;而8個小種在CBB23葉片上誘導的病斑長度都不足1 cm,CBB23對白葉枯菌表現出了明顯的廣譜高抗性。值得注意的是,在之前的報道中,發現P8打破了Xa21基因介導的抗性,在IRBB21上誘導超過10 cm長的病斑[34]。本研究中,P8在2個感病對照TP309和IR24,以及單基因抗病系IRBB3上誘導的病斑長度都是8個小種中最長的,表現出最強的致病性。這個結果表明,在長期的病原菌和寄主互作中,P8克服了多個抗病基因介導的抗性,同樣地,其他小種也有可能發生致病性的變化,因此,有必要對常用小種的致病性進行鑒定,以便及時發現毒性變異的致病菌。

A.8個小種在近等基因系上致病的圖像;B.8個小種在近等基因系上誘導的病斑長度。P1，P2，P3，P4，P6，P7，P8，P10.Xoo小種。TP309和IR24.感病對照; IRBB3、IRBB21、IRBB5、CBB23.單基因抗病系;IRBB54、IRBB50和IRBB59.多基因抗病系。

2.4 基因聚合后的抗性疊加效應

xa5+Xa21基因聚合后對8個小種都表現出正向的抗性疊加效應[34]。而xa5與Xa4基因聚合后正向的抗性疊加效應不明顯(圖3)。基因聚合系中抗性正向疊加效應最顯著的是含xa5+Xa21+xa13三基因組合的IRBB59。IRBB59和CBB23一樣,8個小種在IRBB59葉片上誘導的病斑長度都不足1 cm,表現出明顯的廣譜高抗性(圖3)。xa5+Xa21、xa5+Xa4、xa5+Xa21+xa13的基因組合對P8的抗性都達到高抗病的水平,表明了上述基因組合能有效抵御P8的侵染,也說明了基因聚合策略對選育持久廣譜抗性水稻品種的有效性。

3 討論與結論

Zhang等[30]報道顯示IRBB21對10個菲律賓小種中的P10敏感，對其余9個小種都具有抗性。而在我們的之前研究中，IRBB21對P10中度感病，對P8則完全敏感[34]。本研究的結果發現IRBB3對P1、P2、P3、P4達到了中度感病的水平，而Xiang等[38]的報道顯示，攜帶Xa3的水稻品種對P1、P2、P3、P4、P5和P9都表現出抗性的表型。這些結果表明,不同實驗室保存命名的相同的小種在致病性上不一定完全相同,這種情況或是由于培養條件的不同,使得小種在保存的過程中發生了突變,亦或是在培養過程中出現了操作失誤,導致常用的小種混淆或是污染等,可以在后續的研究中繼續關注。

P8對Xa21介導抗性的突破以及其他抗病基因,比如Xa4[15]抗性被突破的事實,提示育種家關注單個抗病基因抵御水稻病害的時效性。由于植物和病原菌的協同進化,大面積長時間的種植含單個基因的抗性品系容易導致抗性喪失,聚合育種是增加抗性、減緩抗性喪失的有效手段。單基因系IRBB21對4個菲律賓小種(P1、P7、P8和P10)的抗性已明顯減弱,而Xa21在和xa5聚合后對以上4個小種的抗性明顯提高[34]。Xa21+xa5+xa13的組合更是對所有小種產生了高抗性,病斑長度均不足1 cm。但是,在進行基因組合時,還是要充分考慮2個基因的作用機制。xa5和Xa21、xa13聚合后,表現出了正向的抗性疊加效應,是育種家所期望的。而在之前的報道中,xa5和Xa23/Xa10/Xa27基因聚合后,聚合系的抗性都出現了一定程度的弱化[6,25-26]。根據本研究和前人研究結果,Xa23單基因已經可以對常用的白葉枯菌提供廣譜高抗性[30],和xa5的聚合反而弱化了Xa23的功能。推測其原因,Xa23、Xa10和Xa27基因的一個共同特點是相應的avr基因都是TAL效應子。TAL效應子是由黃單胞菌通過細菌Ⅲ型分泌系統分泌的一類細菌蛋白質,作為轉錄因子,通過結合植物基因的啟動子區來激活植物基因的表達,Xa23、Xa10和Xa27的表達都依賴于其相應的avr基因。以Xa27基因為例,AvrXa27結合在Xa27的啟動子區,誘導其表達使植株產生抗病性,AvrXa27誘導的Xa27的表達需要顯性Xa5的參與。在隱性xa5和Xa27雙基因純合聚合系中,隱性xa5不能行使顯性Xa5的功能,Xa27的激活被弱化,從而使Xa27介導的抗病反應減弱[25]。xa5和Xa21的基因聚合后,2個基因在聚合系IRBB54中的表達都要高于單基因系[34]。xa5和Xa21基因聚合后的抗性增強效應可能也與Xa21和Xa27不同的抗病機制有關。Xa21屬于組成型表達基因,表達不依賴于顯性Xa5的功能。因此,為提高抗性、拓寬抗譜、延緩抗性喪失,聚合育種最好選擇具有不同抗病機制的基因進行組合。

本研究調查了多個單基因抗病系和基因組合抗病系對8個常用的白葉枯病小種的抗性水平,研究結果一方面鑒定了各個抗病系的抗譜,另一方面也揭示了常用致病菌的毒性變異以及基因聚合策略在應付致病菌毒性變異的有效性和可能出現的拮抗效應,在水稻白葉枯病的理論研究和應用研究中應充分考慮這些因素。