施用生物有機肥對番茄果實品質及土壤生物學特性的影響

姜莉莉，王開運，武玉國，王開元，王紅艷

(1.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2.山東農業大學 植物保護學院，山東 泰安 271018；3.山東慧泰華生物技術有限公司,山東 泰安 271000)

在我國農業生產中，因長期大量施用化學肥料和連作種植，出現了土壤退化、連作障礙嚴重、農產品品質下降、生態環境惡化等一系列問題，對食品及環境安全造成嚴重威脅。在此背景下，生物肥料因環境友好、資源節約、綠色安全等優點而受到廣泛關注，在無公害農產品生產中的地位不斷提高[1]。有研究報道，生物肥具有速效、長效和改良土壤的作用。同時，生物肥中所含的功能微生物還可將作物難以吸收的固定態養分轉化為易吸收的形態，提高養分供應速率[2]。近年來，我國生物肥料研究和產業化發展迅速，產業鏈基本形成，系統評價生物肥料在耕地質量提升及農產品品質改善中的作用，對我國農業可持續發展和綠色農產品生產意義重大。

豐田寶生物有機肥(含高效固氮菌生物有機肥)是國家“十二五”科技支撐計劃中土壤改良項目的發明成果，由高效固氮菌、解磷菌、解鉀菌和拮抗菌組成功能菌群，與活化腐殖酸、磷礦粉、鉀礦粉等有機載體混合造粒而成。該生物有機肥在番茄、黃瓜、草莓、葡萄等作物上一次性施用，可完全替代化學肥料，同時還可改善農產品外觀和口感[3]。然而，該生物肥對作物果實品質的改善效果和土壤微生物群落結構的調控機理尚不清楚。本研究以連續4 a 8次施用該生物有機肥的設施番茄及種植土壤為研究對象，分析其與常規施肥處理的土壤養分和微生物群落差異，探求該肥料提升農田地力的效果及機理；同時比較不同施肥方式對番茄綜合品質的影響，為連作土壤的生態改良、生態農業的持續發展和農產品品質的提升提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 供試肥料

豐田寶生物有機肥(含高效固氮菌生物有機肥)，含高效固氮菌、解磷菌、解鉀菌和拮抗菌組成功能菌群，與活化腐殖酸、磷礦粉、鉀礦粉等混合造粒而成，含活菌數≥0.2億/g，有機質含量≥40%，氮、磷、鉀總含量≤4.0%，由山東友邦肥業科技有限公司生產。對照肥料由農戶在當地農資店購置。

1.2 試驗設計

本試驗共設2個處理，處理1：連續施用豐田寶生物有機肥4 a，每年種植2茬番茄，按500 g/株的劑量穴施后移栽番茄幼苗并覆土，澆透水，番茄整個生長期不再追施任何其他肥料；處理2：常規施肥處理，每年施用腐熟雞糞60 m3/hm2和復合肥(15-15-15)1 500 kg/hm2，淺翻入土，起壟后移栽番茄幼苗并澆水，待番茄第1批果實采收后追施沖施肥(15-15-15)150 kg/hm2，之后每隔10～15 d沖施1次，至果實采收結束每一生長季節共沖施8次。每個小區面積20 m2、定植80株為1個重復，每個處理重復3次，隨機分布，處理間設有1.5 m寬的緩沖帶。

1.3 試驗操作

試驗區設在山東省泰安市岱岳區房村鎮西良甫村(N35°57′56.14″, E117°11′23.62″)的設施番茄田，為番茄種植基地核心區，農戶已連續種植番茄10余年，管理經驗豐富。試驗設施為黃淮流域常見的簡易土墻日光溫室，由于連年施用化學肥料，土壤鹽漬化程度較高。每年8月中下旬定植第1茬三葉期番茄幼苗，坐果6層后打頂，次年1月上旬套種第2茬，2月拔第1茬秧，7月拔第2茬秧。2014年8月15日種植第1茬番茄，2018年6月21日末茬拔秧。每茬幼苗移栽前施用2%的吡蟲啉顆粒劑預防煙粉虱危害，移栽后30 d內噴施噻蟲嗪1次防治煙粉虱，番茄坐果期噴施50%烯酰嗎啉·錳鋅可濕性粉劑3次，間隔20～30 d，預防番茄晚疫病等病害，日常管理按照當地常規進行。

1.4 樣品采集與測定

2018年4月16日，采集末茬第1批番茄成熟果實進行品質測定。每個小區隨機挑選9個可商品化果實測量單果質量和果實的橫、縱徑，并計算果型指數。果實勻漿后，減壓干燥測定果實含水量。以NaOH滴定法測定可滴定酸含量。以蒽酮比色法測定可溶性糖含量[4]，鉬藍比色法測定Vc含量[5]，紫外-可見分光光度計法測定番茄紅素含量[6]。2018年6月5日(末茬拔秧前期)，每個處理選取20個點，采集5～15 cm土層土壤樣品，充分混勻、過篩后分成2份，一份以干冰保存并送樣，用于土壤微生物的高通量測定；另一份完全風干，采用常規分析法測定土壤有機質、銨態氮、有效磷、速效鉀含量[7]。

微生物群落多樣性分析由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

抽提基因組DNA，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以帶有Barcode的515F/907R引物進行PCR擴增，產物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行凝膠回收。PCR產物經檢測定量后，按照測序量要求進行相應比例混合后構建Miseq文庫并測序。

Miseq測序得到的PE reads經過拼接、質控和過濾后進行OTU聚類分析和物種分類學分析，基于OTU進行多樣性指數分析，對測序深度的檢測；基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。

1.5 數據處理

數據處理采用Microsoft Excel 2016和SPSS 18.0等軟件進行，差異顯著性采用Duncan新復極差法進行分析。

2 結果與分析

2.1 連續4 a施用含高效固氮菌生物有機肥對番茄果實品質的影響

由表1可知，連續4 a施用該生物有機肥的番茄果實單果質量、果型指數、含水量與常規施肥處理差異不顯著；番茄果實糖酸比4.39，較常規施肥對照3.95提高了11.1%；Vc含量108.2 μg/g，較常規施肥處理100.9 μg/g提高了7.2%；番茄紅素含量49.9 μg/g，較常規施肥對照44.4 μg/g提高了12.4%。由此可見，連續施用該生物有機肥，可顯著提高番茄果實的糖酸比、Vc和番茄紅素含量。同時，連續施用生物有機肥種植的番茄果實果肉為沙性，質地緊實，口感好，表觀光亮，商品質量大幅度提高。

表1 連續4 a施用含高效固氮菌生物有機肥對番茄果實品質的影響

2.2 連續4 a施用含高效固氮菌生物有機肥對土壤養分含量的影響

由表2可知，連續施用生物有機肥4 a 8次，番茄種植土壤的銨態氮含量與常規施肥處理間沒有顯著性差異，表明該肥料中的固氮菌可通過生物固氮完全滿足番茄生長所需的氮素供應。同時，連續4 a施用該生物有機肥處理土壤的有效磷、速效鉀和有機質含量較常規施肥處理分別顯著提高147.0%，38.8%，35.6%。表明該生物肥所含的解磷菌和解鉀菌能夠高效分解土壤中難溶態磷和鉀供植物吸收；而肥料中的腐殖酸、黃腐酸鉀等有機載體也可顯著提高土壤的有機質含量。

表2 連續施用生物有機肥對土壤養分含量的影響

2.3 連續4 a施用含高效固氮菌生物有機肥對土壤細菌群落組成的影響

由圖1可以看出，在屬水平上，連續4 a施用該生物有機肥可降低番茄種植土壤溶桿菌(Lysobacter)、節細菌屬(Arthrobacter)、硝化螺菌屬(Nitrospira)、芽單胞菌(Gemmatimonadaceae)、藍藻細菌(Cyanobacteria)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、噬纖維細菌(Cytophagaceae)的相對豐度；提高鏈霉菌屬(Streptomyces)、特呂珀菌屬(Truepera)、鹽單胞菌(Halomonas)、尿素芽孢桿菌(Ureibacillus)、海源菌(Idiomarina)和芽孢桿菌(Bacillus)的相對豐度。由圖2可以看出，在種水平上，連續施用該生物有機肥可顯著提高土壤芽孢桿菌中阿氏芽孢桿菌(Bacillusasahii)的相對豐度。

CK.常規施肥處理；FTB.連續4 a施用生物有機肥。圖2同。

圖2 不同施肥方式土壤細菌種水平差異顯著性

2.4 連續4 a施用含高效固氮菌生物有機肥對土壤微生物多樣性指數的影響

由表3可以看出，連續施用生物有機肥4 a的番茄種植土壤微生物Coverage和Simpson指數均高于常規施肥對照，Chao和Shannon指數低于常規施肥對照，表明生物有機肥可在一定程度上提高土壤微生物的覆蓋度和優勢度。

表3 連續施用生物有機肥對土壤微生物多樣性指數的影響

3 討論與結論

土壤是生態系統中物質循環與能量流動的重要場所，也是微生物參與化學反應的載體[8]。不同的施肥措施對土壤肥力及微生態環境影響較大。許云翔等[9]報道，施用生物炭6 a后，稻田土壤有機碳、有效磷和速效鉀含量顯著增加，增幅分別為34.6%，12.4%，26.2%。大量研究表明，生物肥料能將土壤中難溶態的養分轉化為可溶性養分供植物吸收，既可培肥地力，又能改善農產品品質[10]。庫永麗等[11]報道，微生物肥料可顯著提高獼猴桃果園土壤細菌、放線菌與真菌的比值，提高土壤肥力；同時，獼猴桃果實的維生素C和可溶性糖含量提高，可滴定酸含量下降。陳龍等[12]報道，微生物肥料替代15%化肥對干旱區玉米生長的影響與當地最佳施肥水平無顯著差異，但可改善土壤微生物環境。王文慶等[13]報道，施用0681微生物肥料可以改善土壤微生物菌群結構，增強土壤的持水、緩沖、保肥能力，減輕山藥病害發生。Li等[14]報道，生物肥料替代40%的化學肥料可以顯著提高土壤有機碳和可溶性有機碳含量，增加土壤中芽孢桿菌、木霉菌和假單胞菌等益生菌的豐度，降低鐮刀菌和輪枝菌等病原菌的數量。筆者團隊前期報道，施用含高效固氮菌、解磷菌、解鉀菌和拮抗菌生物有機肥替代化學肥料，可使設施番茄產量提高18.81%～22.30%[15]，但其對土壤生物學特性的影響尚不清楚。磷和鉀是植物生長所需的重要元素，但土壤中95%以上的磷和90%～98%的鉀不能被植物直接吸收利用[16]。本研究發現，連續4 a穴施8次豐田寶生物有機肥完全替代化學肥料，可滿足番茄生長所需的氮素供應，這可能與高效固氮菌的生物固氮作用有關；還可顯著提高土壤有效磷、速效鉀和有機質含量，這可能與該肥料中添加的解磷菌、解鉀菌及磷礦粉、鉀礦粉有關。同時，該肥料也顯著提高了番茄果實的糖酸比、Vc和番茄紅素的含量，改善了番茄的綜合品質。

由于土壤微生物種類繁多、數量巨大，傳統的分離培養方法難以全面反映土壤微生物群落結構的實際情況[17]。高通量測序技術為土壤微生物多樣性分析提供了極大的技術支持。任天寶等[18]采用高通量測序技術研究表明，以生物炭處理的植煙土壤放線菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、裝甲菌門(Armatimonadetes)的群落豐度明顯提高。本研究采用高通量測序技術分析發現，常規施肥處理的番茄種植土壤中硝化螺菌的相對豐度較高，可能與化學氮肥的大量施用有關[19]，導致部分銨態氮轉化為硝態氮；溶桿菌和芽單胞菌相對豐度較高，可能是由于其與硝態氮呈正相關[20]；噬纖維細菌的相對豐度較高，這可能與雞糞中纖維素含量較高有關[21]。連續4 a施用含高效固氮菌生物有機肥處理的番茄種植土壤鏈霉菌屬相對豐度較高，可能是由于其與土壤有效磷呈正相關[19]；特呂珀菌屬、尿素芽孢桿菌和芽孢桿菌的相對豐度較高，表明該生物肥可提高土壤益生菌的相對豐度[22-23]，其中對阿氏芽孢桿菌的提高效果最為顯著，這與Wang等[24]報道的以海藻肥替代化學肥料種植番茄可顯著提高土壤阿氏芽孢桿菌相對豐度的結果一致。Feng等[25]也報道，土壤阿氏芽孢桿菌對有機肥處理的反應最直接，其需要2～4 a的時間演變成為土壤優勢種群，土壤阿氏芽孢桿菌相對豐度的提高對作物產量和土壤肥力的提高具有重要意義。由此可見，連續4 a施用含高效固氮菌生物有機肥可提高土壤益生菌的相對豐度，改良土壤微生態結構，有利于番茄健壯栽培。

微生物群落結構可通過多種指數進行表征[26]。Chao指數是主要用于估計群落樣品中包含的物種總數。Coverage指數是一個較為常用的測序深度指數，其在計算中加入了只含有1條序列的OUT數目和抽樣中出現的總序列數目，能較為真實的反映樣品的測序深度。Shannon指數考慮到樣品中的分類總數和每個分類所占的比例，群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數越大。Simpson指數通過計算隨機取樣的2個個體屬于不同種的概率，來表征群落內物種分布的多樣性和均勻度[27-28]。提高微生物群落的多樣性有助于提高土壤生態系統的生產力、穩定性和可持續性[29]。本研究發現，連續施用該生物有機肥4 a的番茄種植土壤，其微生物Coverage和Simpson指數均高于常規施肥對照，Chao和Shannon指數均低于常規施肥對照，表明該生物有機肥可在一定程度上提高土壤微生物的覆蓋度和優勢度。