SLP-2 在常見消化系統腫瘤中的研究進展

潘世銳，王學紅通信作者)

(1.青海大學，青海 西寧 810000 ；2.青海大學附屬醫院，青海 西寧 810000 ）

0 引言

在我國包括食管癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌等在內的消化系統腫瘤發病率逐年上升，但其發病機制目前尚未完全獲悉，因此積極尋找導致腫瘤發生、發展的因素對控制和減少消化系統腫瘤發病具有重要意義。

2000 年耶魯大學醫學院病理系Wang[1]等從紅細胞膜中分離出一種參與離子通道通透性、機械傳導和脂質結構的膜本體蛋白，并命名為SLP-2(Stomatin like protein-2)，歸類于band7/mec-2 家族，起連接細胞骨架和膜蛋白的紐帶的作用，認為其可能是參與調節鞘磷脂和高膽固醇脂筏的離子通道電導的組織結構。研究發現SLP-2 屬于Stomatin 基因超家族中的一員。該基因超家族一直被認為是一個涉及stomatins、prohibitins、flotillins、HflK/C 蛋白以及植物病反應基因的超家族。它的同源物SLP-1、SLP-2 和 SLP-3 在果蠅、線蟲、植物和細菌中均有發現。相對于SLP-1 和SLP-3 這兩個同系物，SLP-2 缺乏NH2-端疏水結構域，而這種跨膜結構域是SLP-1 和SLP-3 所共有的[1,2]。近年來許多研究表明SLP-2與腫瘤的發生、發展，及腫瘤細胞的增殖、凋亡、粘附及侵襲等密切相關。現就SLP-2 在消化道腫瘤的研究進展作一綜述，以期為消化道腫瘤早期診斷、治療及預后提供思路。

1 SLP-2 的結構和功能

SLP-2 也稱StomL2,人類SLP-2 基因HUSLP2 定位于染色體9p13.3 上，長度為3250bp，由十個外顯子組成，被九個內含子打斷，SLP-2 的預測多肽序列可劃分為三個主要結構域：N 端α 螺旋區；與HSA stomatin 多肽的172 個氨基酸區域具有顯著相似性的結構域；和由交替的α 螺旋和β 折疊結構以及一個C 末端結構域（主要為α 螺旋）組成。值得注意的是這個基因的5 個轉錄本中的一個1.3kbmRNA 轉錄本廣泛表達，翻譯長度為356 個殘基，通常形成預測分子量為38.5kda 的356 個氨基酸殘基多肽。SLP-2 不同與Stomatin 其他家族成員的是其不具有一個特征性的NH2-末端疏水結構域。編碼SLP-2 的單個1.3-kbmRNA 轉錄物普遍存在，與其他組織相比，骨骼肌和心臟中的水平相對較高。更重要的是SLP-2基因在某些癌癥中已重新排列，并被認為含有色素異常增生的基因[2]。

SLP-2 最初被認為是一種細胞質，可能作為一種質膜相關蛋白參與外周膜骨架的形成。然而，隨后的蛋白質組學研究揭示了線粒體中存在SLP-2，造成這一現象可能是由于紅細胞膜上沒有線粒體所致。另外，雖然在同一種細胞類型中，但線粒體β 鏈ATP 合成酶是一種被證實同時存在于線粒體和質膜上，因此具有雙重定位[3]。2007 年Hájek 等[4]用抗SLP-2 抗體進行免疫印跡分析，結果表明SLP-2 可以與MFN2(線粒體融合介質)抗體特異性免疫沉淀，應用包括來自甲醛交聯和SDS 裂解以及用數字蛋白溶解的細胞進行免疫細胞化學和細胞分餾實驗,結果都支持SLP-2 確實是線粒體蛋白的結論。此外，線粒體膜電位依賴性輸入SLP-2 并伴有蛋白水解酶處理和亞定位的實驗結果表明，SLP-2 與線粒體內膜面向膜間隙。值得注意的是，甲醛交聯揭示了高分子量蛋白質物種的“階梯”，表明高分子量SLP-2-MFN2 雜寡聚物的存在。短干擾RNA 法對SLP-2 的敲除顯示線粒體膜電位降低，但線粒體形態沒有明顯變化。DaCruz 等[3]進一步證實了SLP-2 是一種附著在線粒體內膜上的蛋白質，研究表明，SLP-2 與prohibitins 相互作用，并且由于金屬蛋白酶促進蛋白水解，SLP-2 耗竭的HeLa 細胞伴隨著prohibitins 蛋白水平以及復合物I 和IV 亞單位蛋白水平的下降。此外，他們還發現SLP-2 在線粒體應激條件下表達上調，導致蛋白質周轉增加。這表明SLP-2 在調節呼吸鏈復合體的prohibitins和亞單位的穩定性方面起作用。在SLP-2 缺失的細胞中，prohibitins-1 和prohibitins-2 的蛋白水平顯著降低，這表明SLP-2 可能通過與該蛋白的直接或間接相互作用來調節prohibitins 的穩定性。一直以來，prohibitins 被證明是穩定線粒體呼吸鏈復合體亞單位和控制其組裝所必需的。并證實了氯霉素(CAP)誘導線粒體應激后，prohibitins 水平顯著升高，表明在CAP 培養的細胞中，SLP-2 是提高prohibitins-1 水平所必需的。這一結果進一步支持了prohibitins-1 的穩定性直接或間接依賴于SLP-2 的研究結果。這些研究均表明SLP-2可能在控制線粒體蛋白水解中發揮作用。該團隊[5]又進一步通過過度表達或RNA 干擾，在HeLa 細胞中調節SLP-2 的表達水平，用熒光線粒體靶向Ca+探針研究線粒體Ca+的流動，結果提示SLP-2 調節線粒體Ca+穩態，可能是通過抑制鈉鈣交換器活性，在SLP-2 不表達或低表達的細胞中Ca+升高的幅度和持續時間減少，線粒體在組胺刺激下儲存Ca+的能力也隨之降低，而在SLP-2 正常表達的細胞中則表現出相反的結果。

Panagiotis 等[6]報道了SLP-2 與線粒體脂質心磷脂結合，并與prohibitin-1 和2 相互作用，在線粒體內膜形成特殊的膜微域，這與線粒體的最佳呼吸有關。使能量產生幾乎完全來自氧化磷酸化的條件下，對來自T 細胞選擇性SLP-2 基因敲除小鼠的原代T 細胞進行了生物能分析。這些細胞具有表型特征，其特征在于增加未耦合的線粒體呼吸功能和降低的線粒體膜電位。由于線粒體呼吸鏈超復合物（RCS）的形成可能與氧化磷酸化過程中更有效的電子轉移相關，在沒有SLP-2 的情況下，T 細胞的復合物I-III2和I-III2-IV（1-3）RCS 的水平和活性降低，但單個呼吸系統復合物的組裝沒有缺陷。在限制糖酵解的條件下，SLP-2 缺陷T 細胞中RCS 的形成受損與T 細胞增殖明顯延遲有關，這是由于激活引起的。因此確定SLP-2 是體內RCS 形成的關鍵調節劑，并表明這些超復合物是最佳細胞功能所必需的。進一步研究發現[7]通過35S-蛋氨酸/半胱氨酸脈沖標記的SLP-2 基因敲除特異性T 細胞小鼠，在T 細胞激活后，發現包括Cytb、COXI, COXII, COXIII, 和ATP6 在內的幾種線粒體DNA 編碼多肽的產生有明顯的損傷。測量了線粒體DNA 的穩定性和轉錄表明，這種損傷處于轉錄后水平。檢查了線粒體核糖體組裝表明，SLP-2 在蔗糖密度梯度中遷移，類似于大的核糖體亞基，但其在遺傳水平上的缺失并不影響線粒體核糖體的組裝。在功能上，線粒體翻譯的損害與活化的T 細胞白細胞介素-2 產生的減少有關，而這些數據表明SLP-2 是線粒體翻譯的一般調節因子。

Wang 等[8]利用SLP-2siRNA 靶敲除SLP-2 后發現腫瘤細胞的運動、增殖均受到抑制，細胞周期也出現輕微改變，而細胞凋亡無明顯變化。此外，通過與不同化療試劑的聯合應用，發現SLP-2 耗竭對細胞化療敏感性增強，通過線粒體膜電位維持產生能量過程中起作用，進而影響腫瘤細胞的運動、增殖和化療敏感性。DarahA 等[9]通過培養SLP-2 缺乏的特異性T 細胞小鼠，發現SLP-2 缺乏的T 細胞主要是在CD4 室內有缺陷效應反應，該團隊認為SLP-2 是線粒體膜分隔的重要調節因子。Saiful 等[10]發現脂質轉運體ABCA1 調節蛋白質筏的儲備，并鑒定SLP-2 是蛋白質筏組成和天然免疫反應的ABCA1 依賴性調節因子。總的來說，經過不斷深入研究，已經可以明確SLP-2 為線粒體膜蛋白，SLP-2 的缺失會導致線粒體翻譯呼吸鏈和ATP 合酶復合物等多種核心多肽受損并減弱線粒體內Ca2+外流速率，相反，SLP-2 高表達則增加Ca2+從線粒體內外流的速率。而SLP-2 的高表達與腫瘤細胞運動、增殖有著密切關系。

2 SLP-2 與消化系統腫瘤

2.1 SLP-2 與食管癌

食管鱗狀細胞癌(ESCC)是一種在全球范圍內高度流行的癌癥，預后較差，在我國人群中常有報道[11]。參與ESCC 發展的分子機制尚不清楚，ESCC 仍是預后不良的疾病。張立勇[12]等應用cDNA 微陣列比較分析了食管鱗癌配對組織的SLP-2 高表達，并將TE12（一種食管鱗癌細胞系）中導入反義SLP-2，其mRNA 表達明顯降低，可引起S 期阻滯，并抑制細胞生長和繁殖，表明SLP-2 可促進食管鱗癌過度生長和增殖，而在細胞培養時發現SLP-2 基因反義轉染和空載體轉染的細胞克隆時SLP-2 基因反義轉染的細胞容易脫壁,而細胞粘附功能的改變是腫瘤細胞侵襲與轉移的主要因素之一,表明SLP-2 參與食管鱗癌的轉移。Cao 等[13]通過18 例ESCC組織與正常食管黏膜上皮相對比，有13 例在蛋白水平上顯示出SLP-2 的較高水平表達（72.2%，13/18）。SLP-2 的高表達與ESCC 侵襲程度相關（P= 0.033），與其他臨床病理特征無關（P＞ 0.05）。該團隊的進一步研究[14]表明，SLP-2 在腫瘤轉移和侵襲中的作用更加重要，而SLP-2 的上調參與了MAPK/ERK 通路的激活。宋帥等[15]采用RNA 干擾技術，建立目的基因SLP-2 被特異性抑制表達但熒光素酶穩定表達的食管鱗癌細胞株，建立雌性裸鼠移植瘤，通過對比證實SLP-2參與食管鱗癌的發生、發展過程，降低SLP-2 的表達可抑制食管鱗癌的生長。以上研究均證實了SLP-2 的高表達與食管癌的發生、發展、侵襲及轉移關系密切。

2.2 SLP-2 與胃癌

過去數十年,胃癌的平均發病率在整個中國和乃至世界的大范圍內穩步地急劇下降;然而,胃癌仍然被世界認為是第五大最常見的惡性腫瘤,2018 年確診病例超過100 萬例,幾乎三分之二發生在發展中國家[16]。目前對于胃癌的研究尚在不斷深入，Liu 等[17]在原發性胃癌和配對正常胃粘膜組織中，通過RT-PCR（n=16）及Westernblot 分析(n=32) 從mRNA 和蛋白水平檢測SLP-2 的表達量，并且應用免疫組織化學(IHC)檢測了石蠟包埋的胃癌標本（n=113 例）、配對的正常胃癌標本（n=30 例）和成對的轉移淋巴結標本（n=30例）,結果顯示，在低表達的胃癌組織中,SLP-2 的良性表達水平明顯高于癌旁正常的胃粘膜(P＜0.001),高表達與觀察腫瘤浸潤區域深度、淋巴結及遠處是否轉移、TNM 分期顯著相關(P＜0.05)，運用多因素分析COX 回歸模型中，表達升高的SLP-2 可作為一個獨立的預后因素(p=0.005)，提示胃癌的進展和預后與SLP-2 的過表達有關。Li 等[18]在一項大樣本回顧性調查研究中應用免疫組化檢查對451 例原發性胃癌和45 例癌旁胃黏膜組織SLP-2 的促表達研究發現，SLP-2的高表達率為69.8%，低表達為30.2%，且SLP-2 的表達與腫瘤大小密切相關，在隨訪的12 年中，451 例胃腺癌患者中225 位死亡，226 位活著，5 年生存率為55%，中位生存期為68 個月，低表達SLP-2 患者相比高表達患者表現出更長的總生存期（中位數分別為38.9、64.0 個月，P＜0.001），而高表達的SLP-2 與腫瘤進展(TNM 分期)惡性表型（組織學分級）密切相關。張劍團隊[19]應用免疫組化檢測胃腺癌及癌旁正常胃粘膜中SLP-2 表達情況，得出胃腺癌組織較癌旁正常胃粘膜中SLP-2 表達量增高的結論，并應用SLP-2 siRNA 轉染SGC7901 細胞（一種胃癌細胞系）發現，對比結果顯示該細胞的侵襲能力明顯變弱，說明SLP-2 可能參與胃腺癌的轉移，促進胃腺癌的運動侵襲能力。

2.3 SLP-2 與結直腸癌（CRC）

根據世界衛生組織國際癌癥研究中心(IARC)的統計，CRC 的新發病率和死亡率居世界第三位[20]。ZHANG 等[21]用免疫組織化學染色法檢測腫瘤SLP-2 蛋白表達。用RTPCR 的方法檢測腫瘤SLP-2 的mRNA 蛋白表達。該研究結果顯示直腸癌組織中腫瘤SLP-2 表達的蛋白含量明顯地高于癌旁正常的腫瘤組織(68.0%～24.0%,P＜0.05),此外,該研究結果證實腫瘤SLP-2 的蛋白表達量和分子水平與惡性腫瘤TNM 分期和淋巴轉移顯著相關，CCBE1 的表達與SLP-2呈正相關，CCBE1 增強了淋巴細胞轉移。類似的，GUO 等[22]通過基因組和分子干預檢測技術在基因組和分子干預水平上進一步地探討了腫瘤SLP-2 在腫瘤CRC 侵襲和淋巴細胞轉移中的重要作用。該研究結果表明,SLP-2 在CRC 組織中的陽性表達率高于鄰近非癌組織(P＜0.05);SLP-2 的陽性表達預測CRC 患者預后較差,是一個獨立的危險因素。這些研究表明SLP-2 高表達與結直腸癌的發生及預后相關。

2.4 SLP-2 與肝癌

肝細胞癌(HCC)是慢性肝病和肝硬化患者的一種原發性肝癌，與大多數實體腫瘤相比，由于肝炎病毒(HBV 和HCV)感染和酒精使用，其發病率在世界范圍內逐年增加[23]。Pu等[24]通過沉默SLP-2 抑制脂多糖(LPS)的產生并降低CD14和CDC42 的mRNA 水平，進而抑制腫瘤壞死因子TNF-α 和IL-6 的表達水平。過表達的CD14 不僅顯著逆轉了SLP-2 沉默的促凋亡能力，而且還促進了CDC42 的表達和TNF-α 及IL-6 的產生，通過沉默SLP-2 可抑制CD14 降低LPS/TLR4信號轉導并顯著逆轉SK-Hep1 細胞（一種人肝癌細胞系）的炎癥反應和腫瘤進展。Huang 等[25]首次證明SLP-2 在肝細胞癌（HCC）組織中的過表達。作為一種有效的機體調節免疫因子,參與抑制人體癌細胞的惡性增殖、遷移、侵襲、細胞核的凋亡，同時抑制人體上皮細胞組織中中性粒細胞-間質補充質的細胞轉化（EMT）。這些研究表明SLP-2 與肝癌有著密切關系。

2.5 SLP-2 與胰腺癌

胰腺癌(PC)被認為是最致命的癌癥類型之一,主要原因是由于早期診斷的延遲、高度轉移的能力和早期侵襲性等。盡管在其最致命的癌癥發病類型的臨床治療和早期診斷管理方面已經取得了突破性的進展,但對于PC 的早期臨床治療和管理仍然有限,這對于患者的健康至關重要。事實上,PC晚期患者的中位腫瘤平均生存期僅大約為6-9 個月,5 年后中位生存率低至9%[26]。然而SLP-2 與胰腺癌的研究相對較少。NING 等[27]為了尋找合適的胰腺癌腫瘤標志物，從5 個候選胰腺癌相關膜抗原進行篩選，應用于免疫組織化學和染色檢查的研究發現SLP-2 在胰腺癌腫瘤組織中呈顯著性高水平的表達,而在正常胰腺組織中呈低水平表達(P＜0.01)，提示SLP-2 有望作為合適的胰腺癌腫瘤標志物。

2.6 SLP-2 與膽囊癌

膽囊癌(GBC)發病率在胃腸道腫瘤中排名第六[28]。膽囊癌不同于其他惡性腫瘤，因為傳統的檢測方法和早期發現及預防措施未能達到預期效果。Wang 等[29]用qRT-PCR 方法分析了18 對GBC 和鄰近非癌組織,發現其中15 例（83.3%）中SLP-2mRNA 的表達明顯較高，免疫組織化學分析結果顯示，SLP-2 在人體癌細胞組織中的表達與患者性別、年齡和腫瘤大小無顯著關系，與患者組織學分級(P＜0.001)、病理T期(P=0.019)、臨床分期(P=0.001) 和淋巴結轉移密切相關。根據Kaplan-Meier 生存分析，高水平SLP-2 表達患者的5 年總生存率明顯低于低SLP-2 表達患者。這一結果表明SLP-2具備作為GBC 患者整體生存的獨立預測因子的巨大潛力。

3 展望與小結

SLP-2 在發現之初，被認為是一種細胞質，可能是一種質膜相關蛋白。后來的研究發現，SLP-2 存在于線粒體內膜，SLP-2 缺乏導致線粒體呼吸功能改變，SLP-2 在調節特定線粒體蛋白穩定性中有一定作用，多項研究表明，包括消化道腫瘤在內的多種惡性腫瘤中SLP-2 均呈高水平表達，通過siRNA 沉默SLP-2 表達的腫瘤細胞明顯表現為增殖、遷移受阻，可以肯定的是SLP-2 對于腫瘤細胞的生長、增殖有關，至于其中深層次的機制仍需進一步研究。

基因組學的最新技術和分析進展現在已經使快速識別和解釋單個患者疾病背后的基因變異成為可能，從而為了解導致或促成疾病的特定機制提供了窗口，這最終可能使這些機制成為“精確”靶向[30]。而SLP-2 作為一種線粒體內膜相關蛋白參與細胞氧化呼吸等關鍵功能，并在多種腫瘤中高表達，雖然因缺乏特異性而無法作為某種腫瘤的特異性標志物，但有望作為腫瘤診斷和治療新的靶點，為更多癌癥患者的診斷和治療提供新的研究方向。