FOXO1影響胰島β細胞去分化作用機制研究＊

李盼盼，代 培，蘇 通，丁 雷，董笑克，郭翔宇

（北京中醫藥大學東方醫院 北京 100078）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是全世界最主要的慢性非傳染性疾病之一，2013年的流行病學調查結果顯示，我國DM 患病率為10.4%[1]。在最近發表的4C研究（China Cardiometabolic Disease and Cancer Cohort Study）中發現，歐美人2 型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）的最重要的發病機制是胰島素抵抗，而中國人則是在β細胞功能缺陷的基礎上合并胰島素抵抗[2]。以往認為導致β細胞功能缺陷的主要的原因是細胞凋亡，近年來研究表明β細胞去分化才是β細胞功能缺陷的主要原因。叉頭框轉錄因子（FOXO1）是參與β細胞增值、凋亡、分化的關鍵核轉錄子，大量的實驗證明FOXO1 與β細胞去分化有著密切的關系，但對于FOXO1 參與β細胞去分化的具體機制以及抑制和逆轉β細胞去分化的干預措施方面，尚缺乏系統的整理和論述，本文就FOXO1 影響β細胞去分化的作用機制，及抑制和逆轉β細胞去分化的干預措施做一系統綜述。

1 β細胞的增殖凋亡與去分化

胰腺是由α細胞、β細胞、生長抑素細胞以及少量的PP 細胞構成的，其中最主要的細胞是β細胞，體內唯一能夠降低血糖的胰島素正是由β細胞分泌的[3]。β細胞最初是從多功能祖細胞分化來的，其生長速度在胚胎后期和新生兒時期是最高的，然后逐漸下降到成年期，嬰兒時期的β細胞增殖的調節對成人時期的β細胞的質量至關重要[4]。

β細胞的功能缺陷或衰竭在2 型糖尿病患者明確診斷時，甚至在糖尿病的早期階段就已經發生了，隨著疾病的進展，衰竭的程度不斷加劇。過去認為，β細胞功能衰竭的機制是細胞凋亡，主要為糖毒性、脂毒性以及淀粉樣變性[5]。糖毒性使得β細胞內的葡萄糖超出了β細胞的糖酵解的能力，造成氧化損傷；脂毒性狀態下，飽和游離脂肪酸刺激炎癥通路，引起氧化損傷和內質網應激，導致β細胞的功能障礙[6,7]。尸檢發現90%以上的T2DM都存在胰島的淀粉樣變性[8]，細胞的RNA 和功能蛋白的生成都會受到其變性物質的損傷，造成細胞核的固縮，DNA 鏈的斷裂，細胞質表層發生水泡樣突起，最終誘導β細胞的凋亡[9]。

最近大量的研究表明，糖尿病患者的β細胞更多的是經歷了一個“去分化”的過程，而不是細胞凋亡[10]。胰島β細胞的去分化是指β細胞基因蛋白層面發生變化，導致細胞的表型發生改變，使得已經分化為具有正常功能的β細胞出現了逆生長趨勢，失去其作為成熟β細胞的標志物，部分或者完全無法分泌胰島素，表現為祖細胞標志物增多，并且去分化的β細胞或可能轉化為胰島的其他細胞。β細胞去分化作為胰島β細胞障礙的新機制是從1999年開始逐漸被認識的。2004年，有研究者在體外胰島細胞實驗中發現了β細胞的上皮細胞在實驗過程中向間充質細胞轉變的現象[11]；在2008年，有研究者發現在尸供者的胰腺標本中，與匹配的對照組（包括但不限于年齡、性別等）相比，被診斷為T2DM 患者的β細胞質量減少了約50%，而少量的凋亡的β細胞并不能完全解釋這種現象[12]；2012年，Talchai 等[13]報道了β細胞去分化是β細胞功能衰竭的機制之一；之后在2017年，Wang 等[14]通過總結得出導致T2DM 患者β細胞功能障礙和胰島素分泌不足的主要機制是β細胞的去分化，而不是細胞凋亡。

2 FOXO1對β細胞去分化的影響

叉頭框轉錄因子是一組蛋白家族，其特征是翼狀的DNA 結合區，FOX 作為這組轉錄因子的表示符號是在2000年才被采用的[15]。FOX 家族的共有特點是FOX 的結構域，由100 個左右的氨基酸構成，擁有3 個α螺旋以及2 個翅膀狀的環狀結構。FOX 轉錄因子一共有17 個亞家族，其中FOXO 是O 亞族，FOXO 有5 個氨基酸嵌入到第2和第3個α螺旋中，這是它區別于其余 亞 家 族 的 關 鍵。FOXO1、FOXO3a、FOXO4 以 及FOXO6 是人體中的4 個FOXO 的共同起源基因，FOXO1 是其中被最早發現的一員。胰腺及具有其效應的靶細胞是FOXO1 最重要的表達場所，包括肝細胞、肌肉細胞、脂肪細胞。需要注意的是，雖然其在胚胎階段表達于全部胰腺，但它在成年胰腺中僅表達于β細胞中。

許多研究報告稱，FOXO1的轉錄活性受到翻譯后修飾的調節，如磷酸化、乙酰化以及泛素化。基于磷酸化和乙酰化的作用，FOXO1可以在細胞核質之中游走[16]。FOXO1 磷酸化是通過胰島素等作用于胰島素受體，受體底物進一步激活PI3K/AKT 通路，誘使AKT磷酸化而實現的，FOXO1 的磷酸化能夠加快FOXO1的核輸出，使得其核定位受到阻礙，阻止FOXO1 蛋白重新返回細胞核內，這一過程使得FOXO1在胰島素信號轉導中起負性調節作用；P300，CBP等相關因子可以使FOXO1 乙酰化，而組蛋白去乙酰基酶（Histone deacetylase，HDAC）可以使FOXO1 去乙酰化，FOXO1乙酰化可以減慢FOXO1 和DNA 的轉錄，使得FOXO1對AKT 的磷酸化更加敏感，以此來調節轉錄活性[17]；泛素化可以降解大部分的蛋白，FOXO1的泛素化可以使其通過蛋白酶體發生降解，縮短FOXO1蛋白的半衰期，保持其蛋白水平的穩定性[18]。

除FOXO1 外，影響和調控T2DM 中的β細胞分化和功能損害的轉錄因子還包括胰島胰腺十二指腸同源盒1（Pancreatic and duodenal homeobox 1，PDX1）、RFX6 轉 錄 因 子、NKX6 轉 錄 因 子 相 關1（NK6 transcription factor related, locus 1，NKX6.1）和肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系 A（Musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A，MafA）等。這些轉錄因子之間存在著密切的聯系，其中FOXO1在成人胰腺β細胞中最顯著的作用就是對PDX1 的負轉錄調節[19]。PDX1 既可以促進β細胞增殖，又可以通過增加抗凋亡蛋白和減弱凋亡蛋白的活性來抑制β細胞的凋亡。PDX1 對胰島素具有調節作用，主要是通過與胰島素基因上的特定區域的轉錄因子結合而發揮的，除此之外，PDX1 還可以通過與葡萄糖轉運體（Glucose transporter 2，GLUT2）和葡萄糖激酶（Glucokinase，GK）結合、調節β細胞的線粒體和胰淀素等途徑來影響胰島素的分泌[20]。PDX1的表達受FOXO1的控制，β細胞中FOXO1 過表達導致PDX1 轉錄減少，從而導致機體胰島素分泌缺陷。相反，FOXO1的單倍劑量不足會恢復β細胞中PDX1 的表達，維持β細胞功能[21]。并且由于FOXO1 和PDX1 在細胞核內共定位，所以兩者在核定位上存在著互斥關系，FOXO1 位于PDX1 陽性β細胞的細胞漿中，而位于PDX1 陰性β細胞的細胞核中[22]。Yu等[23]在體外實驗中觀察FOXO1和PDX1的表達和定位，發現使用了FOXO1 的選擇性抑制劑AS1842856 處理后，PDX1 出現在細胞核內，而FOXO1出現在人類胚胎干細胞來源的胰腺祖細胞的細胞質內。同時還發現FOXO1 基因敲除可上調胰腺β細胞分化相關轉錄因子和標記物NKX6.1、PDX1、胰島素、GK和GlUT2的表達水平。

當糖代謝異常時，各種炎性因子，如氧化應激活性氧族（Reactive oxygen species，ROS）、白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）等都被釋放入血，胰島素正常的信號通道受阻，使得FOXO1 不能正常磷酸化，可以在細胞核內觀察到大量的FOXO1 蛋白。血糖升高的早期，胞核內代償性增加的FOXO1能夠使得胰島素基因啟動子（IPF-1/PDX-1）與增強子區的轉錄因子的結合增強，促進β細胞的增殖和分化，進而胰島素會代償性地升高[24]。但當血糖進一步升高，高糖狀態導致的氧化應激持續造成損傷，經mRNA 翻譯的胰島素在內質網不斷地被折疊和修飾，形成新的胰島素元和分子伴侶，未折疊蛋白的不斷增加會形成未折疊蛋白效應，這種情況會造成FOXO1 的數目下降，活性消失，FOXO1 失代償，不能繼續發揮促進β細胞增殖分化的作用[25]，表現為NKX6.1 等成熟β細胞的標志物的數目減少，最終導致胰島β細胞去分化[26]。

Kobayashi等[27]發現敲除了FOXO1的db/db小鼠糖耐量實驗結果異常的概率更大，從而推斷其可能的原因 是β細 胞 缺 乏FOXO1 的 保 護。Kim-Muller 等[24]在T2DM 患者胰腺的體外研究中觀察到雖然胰島β細胞數量有所減少但與功能減退程度不成比例，且胰島β細胞去分化伴有顯著FOXO1 降低。劉嬋等[28]等通過培養小鼠胰島β細胞株MIN6細胞，發現高濃度葡萄糖（35 mL）干預48 h 能下調MafA、PDX1、INS-1 基因在MIN6 細胞中的表達，并且觀察到高糖可以抑制MIN6細胞葡萄糖刺激胰島素分泌的功能以及阻礙FOXO1磷酸化的過程，從而得出高糖狀態可能經由FOXO1的作用導致β細胞的去分化。

有研究者在免疫熒光標記的實驗中觀察到，中等升高的血糖會導致db/db 小鼠的β細胞胰島素免疫熒光降低大概15%-45%，而重度升高的血糖則會造成β細胞的胰島素免疫熒光僅有15%，且能觀察到“空巢”樣變[29]。當高糖導致β細胞去分化后，能在β細胞中觀察到大量的內分泌祖細胞標志物，如前內分泌標記物神經生長素3（Neurogenin 3，Ngn3），以及多能標記物，如Oct4、Nanog 和L-Myc 等。Talchai 等[13]在實驗中使用了敲除FOXO1 的小鼠，發現在基礎條件下，這些小鼠和對照小鼠代謝沒有差別。然而應激條件下（如多次分娩或衰老），敲除FOXO1的小鼠血糖升高，胰島素分泌減少、β細胞的數量減少30%，α細胞數目增加50%，胰高血糖素分泌增加。通過進一步的永久標記發現，小鼠胰腺不再表達PDX-1、MafA和胰島素，而是像它的原始細胞一樣表達Ngn3，以及間充質干細胞如Nanog 等，通過譜系追蹤研究發現，在這些小鼠中，一些α細胞是從以前的去分化β細胞中產生的。上述實驗證實了FOXO1 的功能缺陷可以誘導小鼠β細胞發生去分化，使得成熟β細胞去分化為多能狀態，具有向胰腺α細胞、e細胞和PP細胞多種方向分化的能力[30]。

3 抑制和逆轉β細胞去分化的干預措施

盡可能地抑制和逆轉β細胞的去分化對于糖尿病患者的遠期愈后是極其重要的。生活方式以及飲食的控制可以抑制及逆轉2 型糖尿病患者β細胞去分化，White 等[31]觀察到早期2 型糖尿病患者在減肥后，成熟β細胞標記物如胰島素、PDX1 和MafA 水平顯著增加，說明減肥可能逆轉β細胞的去分化，甚至誘導β細胞再分化，從而逆轉糖尿病發展的進程。鄒瀟等[32]在試驗中使用了普通飲食的小鼠作為正常組，另設高脂飲食組小鼠，和高脂飲食+苯扎貝特組小鼠，發現相較于普通飲食組，高脂飲食組胰島β細胞中的Nanog增多，胰島素和FOXO1 減少，且FOXO1 向細胞核發生轉移，而苯扎貝特治療組胰島素及FOXO1 表達恢復，且Nanog 的數目下降，證實苯扎貝特能夠使得高脂狀態導致的β細胞去分化得到改觀。Ishida 等[33]發現與隨意喂養的db/db 小鼠相比，進食量減半喂養的db/db小鼠的胰島中的β細胞數增加（56%-68%，P=0.01），而α細胞數則沒有變化（2%-4%），β細胞標記物如胰島素、FOXO1、MafA 被恢復，去分化標記物乙醛脫氫酶la3（ALDH la3）被抑制，表明飲食限制可以防止并可能逆轉β細胞的去分化。盡管大量的證據能夠表明減肥和飲食控制等生活方式，可以改善和逆轉β細胞的去分化，然而，研究證實在糖尿病的晚期階段，單純節食作為一種治療方法不再有效，通過飲食控制來逆轉β細胞功能障礙似乎僅限于疾病的最初10年[34]。

在藥物治療中，Wang 等[35]在一項動物實驗中發現使用胰島素可以使得已經發生去分化的β細胞再次分化為具有正常功能的β細胞，他們通過將嚴重糖尿病的KATP-GOF 小鼠（血糖＞500 mg·dL-1，持續約3 周）分為了2組，即未治療組和長期胰島素治療組，發現治療組在經胰島素治療后再分化為具有生成胰島素功能的β細胞，β細胞標志物PDX1、mRNA、NKX6.1 以及MafA 的表達恢復到正常水平，同時祖細胞標志物Ngn3、Oct4、Nanog 和L-Myc 減少，證明了使用胰島素可以逆轉β細胞的去分化，Weng 等人[36]則在一項隨機臨床試驗中觀察到，2 型糖尿病患者在診斷時立即開始持續2-3 周的強化胰島素治療，可以使β細胞功能得到恢復，在停止胰島素治療后，患者還可以繼續保持數月至兩年的血糖正常的狀態。使用短期強化胰島素治療的多個研究表明，大概40%的患者在強化胰島素治療后24個月仍然可以保持正常的血糖水平[37]。

除胰島素外，在GLP-1 受體激動劑的細胞研究中發現，GLP-1 受體激動劑可以通過上調轉錄因子7 類似物2（Transcription factor 7 like 2，Tcf7l2）基因來抑制高糖導致的胰島β細胞的去分化，表現為相較于對照組，祖細胞標志物的表達減少（P＜0.05）[38]。Hou 等[39]將重組蛋白E2HSA 處理組（exendin-4 與人血清白蛋白融合產生的一種新型長效GLP-1 受體激動劑）分別給予1 mg·kg-1、3 mg·kg-1、9 mg·kg-1不同劑量，發現在43 天的治療期間，1 mg·kg-1、3 mg·kg-1和9 mg·kg-1劑量組的E2HSA 均以劑量依賴的方式顯著降低了db/db小鼠空腹血糖水平，并恢復了β細胞形態，增加β細胞面積，抑制β細胞凋亡。E2HSA（9 mg·kg-1）使得IRS2、NKX6.1 和MafA 的表達增加了1.8 倍、上調了PDX1 的表達，增加FOXO1 磷酸化的水平，并且降低了促凋亡Bcl-2 蛋白的表達，這些結果表明E2HSA 促進了β細胞功能的恢復。

其他降糖藥物的研究，目前主要集中在促進β細胞的增殖和保護β細胞功能方面，雖然沒有得出關于β細胞去分化方面的結論，但是很多實驗過程中發現了去分化標志物的變化。例如，在SGLT-2 抑制劑的研究中，Okauchi 等[40]分別給予10 周大的雄性糖尿病db/db 小鼠0.0025%或0.01%的魯格列凈（Luseogliflozin）治療，發現在干預3 天后，與對照組相比，魯格列凈治療組顯著提高了胰島素1、胰島素2、MafA、PDX1 和GLUT2 基因的表達水平，降低了轉化生長因子β信號通路（Transforming growth factor-β，TGFβ）、纖維連接蛋白、I 型膠原和III 型膠原等纖維化相關基因的表達水平；在噻唑烷二酮（Thiazolidinediones，TZDs）類藥物的研究中，Ishida[35]等總結發現，羅格列酮可以恢復FOXO1 在β細胞中的表達。其他降糖藥物如DPP-4抑制劑西格列汀[41]、二甲雙胍[42]均被證實可以改善β細胞的功能，但并沒有抑制和逆轉β細胞去分化方面的報道。

除此之外，也有研究者通過細胞實驗和動物實驗證實腎素- 血管緊張素- 醛固酮系統（reninangiotensin-aldosterone system,RAAS）可能通過作用于血管緊張素受體1（Angiotensin Ⅱreceptor type 1，AT1R），誘導NF-Kb 信號通路的激活從而誘導β細胞去分化。因此，阻斷RAS或NF-Kb信號也可以逆轉血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）誘導的β細胞的去分化狀態[43]。

中藥單體的研究過去主要集中在促進胰島β細胞的增殖方面，現在抑制和逆轉β細胞去分化方面的潛力也開始引起學者的關注[44]。例如，紅景天可促進胰島素、PDX1 等基因的mRNA 表達，降低白細胞介素1β（Interleukin 1 beta，IL-1β）水平，使得β細胞數目增多[45]]。白藜蘆醇能促進β細胞分化和成熟，以及促進干細胞系產生PDX1[46]。兒茶素沒食子酸酯（綠茶提取物）也被證實至少部分可以通過增加IRS2、AKT、FOXO1 和PDX1 的表達來改善β細胞在糖毒性條件下的胰島素分泌功能和生存能力，并且還可保護β細胞免受促炎細胞因子誘導的細胞毒性的傷害[47]。富含花青素-3-葡萄糖苷的楊梅果實提取物（Bayberry fruit extracts，BFE）也被證明可防止氧化應激誘導的β細胞損傷，BFE（含0.5μM 氰化-3-葡萄糖苷）可抑制β細胞內線粒體反應性氧化物生成，以及上調PDX1 與胰島素樣生長因子Ⅱ基因（Insulin-like growth factor 2，IGF-Ⅱ）的表達等[48]。

4 結語

綜上所述，β細胞去分化是導致β細胞功能缺陷的重要機制，且這一過程可以被抑制和逆轉。FOXO1作為可以影響β細胞去分化的重要核轉錄因子，為β細胞功能研究提供了一種新的思路和方向。現有證據表明，飲食和體重的控制，以及使用胰島素對于抑制和逆轉短病程的T2DM 患者的β細胞的去分化確有療效。這個結果也與飲食和運動療法應該保留在整個糖尿病治療過程中的治療理念一致。但對長病程DM患者而言，上述措施對調節β細胞去分化的作用并不明顯。除飲食運動以及胰島素外，其他降糖藥物以及一些中藥提取物在抑制和逆轉β細胞去分化方面也顯示出一定的作用，關于藥物作用于β細胞去分化的潛在機制，需要我們進一步的研究以明確。