微小核糖核酸在乳腺癌中的研究進展

張娜娜,沈 濱,陳 晰,梁文龍,張建國

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院 乳腺外科,黑龍江 哈爾濱,150086)

全球超過226萬女性患乳腺癌，約占所有新確診癌癥人數的11.7%,占女性新確診癌癥人數的24.5%,發病率居女性癌癥首位。目前已有腫瘤相關蛋白如CEA、CA153等用于腫瘤輔助診斷，但敏感性和特異性較低。早期診斷乳腺癌并及時治療是提高患者生存率的關鍵所在，因此需要找到敏感性和特異性較高的檢測方法。微小核糖核酸(miRNAs) 是一類高度保守、長18～25個核苷酸的內源性單鏈非編碼小分子RNA[1-2]。miRNAs由DNA轉錄產生，但不翻譯成蛋白質，而是調節其他基因的蛋白質合成，因此miRNAs 可調控其他蛋白質編碼基因。其參與生物體細胞分化、增殖、衰老、代謝、病毒防御、器官形成、胚胎發育以及免疫應答等生命活動[3-7],與腫瘤、心腦血管疾病、代謝性疾病及免疫性疾病等疾病的發生發展密切相關[8]。在腫瘤中,miRNAs通常以癌基因或抑癌基因的角色參與腫瘤的發生發展。抑癌性 miRNAs(suppressor-miRNAs)與腫瘤發生呈負相關，其表達下調或失活將直接導致腫瘤的發生發展;致癌性miRNAs(onco-miRNAs)與腫瘤發生呈正相關，其過表達或持續活化將直接導致腫瘤的發生發展[9]。miRNAs通過其靶基因、上游轉錄因子及各種反饋調控回路相互交織組成了復雜的生物調控網絡，并參與腫瘤的發生發展機制。存在于外周血和體液中的游離miRNAs (循環miRNAs),具有出現早、穩定性高、組織和腫瘤特異性等優點，是最具潛力的腫瘤分子標志之一，有望應用于乳腺癌的早期診斷、分子分型、療效監測與預后預測等各個階段。

1 miRNAs的形成

核基因組中的miRNA首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉錄為具有莖-環結構(stem-loop struc-ture)的初級miRNA(pri-miRNA),后者被RNA聚合酶Ⅲ-Drosha-DGCR8 復合體切割，形成仍保留莖-環結構的前體miRNA(pre-miRNA)。轉運蛋白輸出蛋白5 (Exportin-5)將識別其突出于3′端的標志并與之結合，借助G蛋白(Ran-GTP)轉運至細胞質。在胞質中，一種叫Dicer的核酶將在雙鏈RNA結合蛋白(TRBP)和AGO蛋白質2(AGO2) 的協助下識別前體miRNA雙鏈的5′末端磷酸及3′末端突出，在RNA聚合酶III的參與下，于莖干的兩個螺旋轉彎處切割復式結構的兩條鏈，形成miRNA:miRNA*復式結構。后者在解旋酶(helicase)的作用下，最終形成成熟的單鏈miRNA(多數為miRNA,miRNA*通常被降解)，進入核蛋白復合體參與形成RNA誘導的沉默復合體(miRISC),進而發揮生物學作用[10-12]。

2 miRNAs在乳腺癌中的功能

miRNAs不僅可調控乳腺相關癌基因、抑癌基因編碼蛋白的表達，也可調控乳腺癌發生發展相關信號途徑中蛋白、微環境中血管上皮細胞、免疫細胞的重要蛋白，并可通過調控藥物靶分子、藥物轉運蛋白、甲基化或組蛋白修飾酶、細胞周期調控蛋白，影響藥物敏感性和繼發耐藥等。miRNAs調控細胞內的轉錄和翻譯，還以微囊或外泌體為載體，通過“細胞間信息傳遞”調控其他細胞。研究[13]發現高轉移性乳腺癌細胞分泌含有miR-200的外泌體，被低轉移性乳腺癌細胞內吞后，轉化為高轉移性乳腺癌細胞。血清外泌體mir-373可作為侵襲性、三陰性和激素受體陰性乳腺癌的生物標志物。血清外泌體miR-105可能具有預測或早期診斷發展或已經發展為乳腺癌轉移的潛力[14]。

2.1 miRNAs與乳腺癌的發生發展以及侵襲轉移

miRNAs 在正常組織及腫瘤中表達存在著顯著差異，這種miRNAs表達的多態現象與腫瘤發生轉移的風險存在正相關或負相關。研究[15]發現在原發性乳腺癌血清中miRNA-21、miRNA-29b、miRNA-29c、miRNA-98、miRNA-181b、miRNA-181d、miRNA-155、miRNA-365表達上調，miRNA-30a-3p、miRNA-31、miRNA-127、miRNA-140、miRNA-320、miRNA-355和miRNA-497表達下調，其中miRNA-21上調最為顯著，與腫瘤進展、淋巴結轉移、生存時間有關。數據表明,miR-182-5p和miR-409-3p降低了Ras抑制蛋白1(RSU1)、PINCH蛋白1(PINCH1),抑制了PTEN(一新發現的抑癌基因)表達的ATF2激活[16]。TINCR(長非編碼lncRNA命名的組織分化誘導非蛋白編碼RNA)在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.001),在癌組織中miR-589-3P表達水平顯著低于正常組織(P<0.001)。TINCR和miR-589-3p表達水平呈負相關(r=-0.331;P=0.006)。Kaplan-Meier總體生存曲線結果表明,TINCR表達高水平的患者在5年內生存率較低(P<0.05)。miR-589-3p可能靶向下調乳腺癌細胞TINCR的表達，抑制乳腺癌細胞增殖，促進其凋亡[17]。miRNA-205在三陰性乳腺癌中表達下調，通過靶向控制ZEB1、ZEB2來減少MET(上皮細胞-間充質轉化)的過程[18]。miR-183/-96/182簇在乳腺癌中表達也上調[19]，其異位表達促使乳腺癌和其他癌細胞[20-21]的細胞增殖、遷移和上皮間充質轉換(EMT)。在乳腺癌中，大約75%的晚期乳腺癌患者檢測到骨骼轉移[22],盡管乳腺癌的治療有所改善，但在骨轉移的發展階段，乳腺癌目前是無法治愈的，因此骨轉移診斷后的中位生存時間在12～53個月[22]。骨轉移降低了患者的生活質量，縮短了患者的預期壽命。在一項關于乳腺癌分子亞型的研究[23]中,Ki67的免疫組織化學染色與人表皮生長因子2(HER2)和雌激素受體(ER)的分析相結合，結果顯示ER陽性HER2陰性腫瘤的骨轉移率較其他亞型高，Ki67評分大于13。研究[24]表明,miR-30家族成員在骨轉移中的作用是通過調控miR-30的過度表達來抑制骨中腫瘤的生長，減少骨破壞，抑制癌細胞侵襲。miR-30水平與ER/PR狀態相關,ER/PR陰性細胞表達的miR-30家族成員水平低于ER/PR陽性細胞[24]。乳腺癌腦轉移同樣是治療的一大難點，血腦屏障限制藥物進入和引起腫瘤細胞死亡，使大腦成為“避難所”。miR-101-3p的表達在腦轉移性乳腺癌細胞中丟失，而miR-101-3p的異位表達通過減少環氧化酶(COX-2)/基質金屬蛋白酶-1(MMP1)表達來減少癌細胞通過腦內皮細胞的遷移，從而干擾內皮間連接，即BCBM(乳腺癌腦轉移)級聯由miRNAs調控[25]。miRNAs通過各種調節通路控制著乳腺癌的發生發展以及侵襲轉移。

2.2 miRNAs與乳腺癌的診斷

一些miRNAs在乳腺癌早期表達異常，循環miRNAs由壞死腫瘤細胞釋放或活腫瘤細胞主動分泌，直接來源于腫瘤細胞[26],可能與腫瘤細胞存在一致性。相關研究[27]選擇5種分子亞型中顯著差異表達的miRNAs和mRNAs,選擇有效的miRNAs和mRNAs子集，用于乳腺癌亞型的分層。6個miRNAs (miR-190b、miR-18a、miR-301a、miR-34c-5p、miR-18b和miR-129-5p),6個mRNAs (HAUS6、LAMA2、TSPAN33、PLEKHM3、GFRA3和DCBLD2),結果表明，所選擇的miRNAs和mRNAs對乳腺癌亞型分層具有重要意義，這12個miRNAs和mRNAs可作為乳腺癌亞型分層的診斷生物標志物。ROTH C等[28]對59例原發乳腺癌患者、30例轉移性乳腺癌患者和29例健康對照者的血清miRNAs比較分析，發現miR-155、miR-10b和miR-34a水平不僅可區分乳腺癌與健康對照，而且可鑒別原發和轉移性乳腺癌。SCHWARZENBACH H等[29]研究了102例術前和34例術后乳腺癌患者、32例良性腫瘤患者和53例健康人血漿miRNAs水平，發現miR-20a和miR-21在良、惡性腫瘤患者均高于健康對照，而乳腺癌患者血漿miR-214顯著高于良性腫瘤患者。可見循環miRNAs具有組織和腫瘤特異性，其含量和組成變化直接反映腫瘤來源和發生，并且有些miRNAs在腫瘤發生的早期出現，具備腫瘤診斷生物標志的潛力。

循環miRNAs對早期乳腺癌檢測敏感性和特異性優于目前臨床常用的腫瘤標志物檢測,LIU L等[30]研究分析表明miRNAs對乳腺癌診斷的總敏感性為77%,特異性為88%。GAO J等[31]對89例早期乳腺癌患者和55例健康對照者分別采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定循環miR-21,用化學熒光法檢測CEA和CA-153,循環miR-21檢測敏感性為87.6%,特異性為87.3%,CEA和CA-153的敏感性分別為22.4%和15.7%。新一代測序和PCR芯片等高通量技術分析循環miRNAs表達譜，可提高檢測的靈敏度。CUK K等[32]篩選出1組miRNAs (miR-127-3p、miR-376a、miR-652、miR-148b、miR-409-3p、miR-801、miR-376c)可鑒別乳腺癌和良性腫瘤(AUC=0.81),且對年輕女性(<50歲)的準確性更高(AUC=0.86)。

血清miRNAs主要檢測方法有克隆測序、RNA印跡雜交、基因芯片、反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)等技術。血清miRNAs穩定，可以抵抗核糖核酸酶 (RNAse)、加熱、pH值變化，并能長期保存和反復凍融，可以實現無創檢測[33]。血清miRNAs能夠作為腫瘤的生物標志物，并可提供一種非損傷性的腫瘤診斷手段。

2.3 miRNAs與乳腺癌的治療

miRNAs的表達失調可以引起多種疾病，因此調控miRNAs的表達也可以作為一種疾病的治療手段。目前應用miRNAs治療腫瘤的策略主要有:① 基因治療，針對在腫瘤組織中下調的miRNA,轉染pre-miRNA糾正miRNAs的表達，抑制腫瘤細胞的增殖或誘導其凋亡;利用反義RNA或小干擾RNA技術，有效抑制某個原癌基因miRNAs的表達。② 藥物治療，利用藥物調控相關miRNA的表達，進而達到治療目的。

KIM S J等[34]發現，在乳腺癌細胞系及乳腺癌癌組織中,miR-145與其靶基因(fascin-1、c-myc,SMAD2/3、IGF-1R等)存在負相關關系，研究者將腺病毒構建的miR-145用于乳腺癌細胞系的體外試驗以及乳腺癌小鼠的體內試驗，發現在體內及體外試驗中腺病毒構建的miR-145均能抑制腫瘤細胞的生長和活力，且miR-145與5-氟尿嘧啶聯合應用抑癌作用更佳，因此miR-145對治療乳腺癌具有價值。KRüTZFELDT J等[35]將與膽固醇偶聯的反義寡聚脫氧核苷酸 (AMO) 注射小鼠靜脈后，體內多種器官的miRNAs表達水平降低，且注射后第3日小鼠體內檢測不到靶向miRNAs，并在數周內都未檢測到，證明修飾AMO能較長時間內有效降低靶miRNAs的水平，因此這種修飾的AMO有可能成為新型治療藥物。丹麥SantarisPharma公司研發的miravirsen (一種靶向抑制miR-122的RNA候選藥物)于2008年進入Ⅰ期臨床試驗治療丙型肝炎病毒感染患者，并于2010年9月進行Ⅱ期臨床試驗，展示了miRNAs藥物用于臨床的可能性。白藜蘆醇上調miR-141和miR-200c在MDA-MB231乳腺癌中的表達。上調miR-141和miR-200c可降低侵襲性和EMT[36]。姜黃素誘導mir-181b,抑制細胞增殖和轉移，促進癌細胞凋亡[37]。在綠茶中發現的表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯可通過上調mir-16和阻礙Bcl2和mir-21抗癌[38]。因此乳腺癌miRNAs藥物有望在臨床上使用。

2.4 miRNAs與乳腺癌的療效監測及預后

miRNAs可調控激素受體、藥物代謝、細胞周期、凋亡、組蛋白修飾和DNA損傷修復等相關蛋白的表達[39],影響腫瘤細胞生長繁殖、侵襲轉移，與乳腺癌的療效及預后密切相關。

HENEGHAN H M等[40]對乳腺癌組和對照組血液中7種候選miRNAs比較分析，確認miR-195和let-7a在乳腺癌中高表達，手術切除腫瘤后分別降低11倍和19倍，因此miR-195和let-7a不僅可診斷乳腺癌，還可作為治療效果評價指標。研究報道miR-10b、miR-21、miR-155表達水平高的TNBC(三陰性乳腺癌)患者預后較差，總生存期和無復發生存期均較短。MADHAVAN D等[41]采用miRNA芯片篩選與循環腫瘤細胞(CTC)狀態相關的miRNAs,在61例陽性(CTC+)、60例低水平和72例陰性(CTC-)轉移性乳腺癌(MBC)患者中驗證，發現血漿miRNAs (miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-210、miR-375、miR-801)在CTC+的MBC患者血漿中水平高于CTC-的MBC患者，其中miR-200b表達差異最為顯著。單獨miR-200b和上述miRNAs表達譜均與總生存期(OS)和無進展生存期(PFS)相關。MADHAVAN D等[41]發現在CTC陽性乳腺癌患者中循環miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-203和miR-210表達水平升高,miR-375和miR-768-3p表達水平降低，循環miRNAs表達譜與患者總生存期的相關性高于CTC狀態。EICHELSER C等[42]研究顯示血漿中外泌體miRNA-373表達水平在TNBC和激素受體陰性(ER-/PR-)乳腺癌患者中高于激素受體陽性(ER+/PR+)乳腺癌患者,miR-373水平與侵襲表型相關。其他研究也相繼發現血漿/血清miR-210、miR-21、miR-155、miR-214、miR-19a等表達水平與淋巴結轉移或遠處轉移相關[43-45]。

3 miRNAs在乳腺癌中的應用前景及存在問題

循環miRNAs具備作為腫瘤生物標志的特征和臨床應用潛力，但在成功應用于臨床之前尚有一些理論和技術問題有待解決:① 乳腺癌與其他腫瘤一樣存在高度異質性，發生和發展過程涉及多個基因的改變，相關miRNAs數量和種類眾多，循環miRNAs既可由壞死腫瘤細胞被動釋放，又可由活細胞主動分泌，因而循環miRNAs的組成和含量可能呈現隨機性和動態波動性;② 研究對象的特征(年齡、種族、病理分期、腫瘤組織學分型和分子亞型)不同，患者的miRNAs表達譜可存在差異;③ 循環miRNAs的研究采用了全血、血漿和血清樣本，全血標本因受到淋巴細胞內miRNAs的干擾，對結果的影響較大;血清和血漿相對更為穩定，但也存在細微差別，因在凝血過程中少量淋巴細胞裂解釋放miRNAs，通常血清中miRNAs濃度略高于血漿;④ qRT-PCR是最常用檢測方法之一,PCR結果的校正方法和參照不同也會產生偏差。在miRNAs的基因治療中也存在需要解決的諸多問題，例如miRNAs與靶mRNA之間的作用依靠序列間的堿基互補配對，且miRNAs可以調控與之不完全配對的靶基因的表達。因此，一個miRNA可以調控多個靶基因的表達，可能產生脫靶效應。如何開發高效的miRNAs傳遞系統是研究的另一個重點，針對不同類型的腫瘤應采用不同的傳遞系統，更合適的傳遞系統仍需進一步研究。

隨著循環miRNAs臨床研究和方法的成熟，可以預期將來miRNAs可應用于臨床腫瘤的早期診斷、用藥指導和預后預測等。