卵巢組織凍存移植安全性的研究進展

程姣姣 阮祥燕* 杜 娟 金鳳羽 李揚璐 谷牧青

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院內分泌科，北京 100026)

由于腫瘤學、非腫瘤學和個人因素，女性對于生育力保護的需求急劇增加。卵巢刺激后成熟卵母細胞冷凍、胚胎凍存、卵巢組織凍存是美國生殖醫學學會認可的生育力保護方法[1-3]。卵巢組織凍存對于青春期前女孩以及性腺毒性治療無法延遲的女性是唯一的生育力保護方法[2-3]。全球已有超過200例嬰兒通過卵巢組織凍存移植技術誕生[4]，凍存卵巢組織移植后約95%患者的卵巢功能可恢復至正常，妊娠率可高達50%，活產率和持續妊娠率約40%[5]，這些數據[6]表明了卵巢組織凍存移植技術的有效性。

但對于白血病、神經母細胞瘤、伯基特淋巴瘤等卵巢攜癌高風險的患者來說[7-9]，卵巢組織移植風險高，可能需要通過其他方法恢復生育力。一些團隊[10-11]已經為白血病患者進行卵巢組織移植且患者成功分娩，未見報道疾病復發。近幾十年，為恢復生育力，并避免惡性細胞再移回體內的風險，世界各地的研究團隊努力開發兩種技術[9, 12]：體外培養卵巢組織[13]和人工卵巢移植[14-15](transplantable artificial ovary, TAO)。第一個指的是在體外實現整個卵泡發生過程，第二個是將分離的竇前卵泡移植回體內的自然環境。這些技術可提高所有凍存卵巢的患者的生育力。生育力保護體外技術的治療潛力是巨大的，但技術是有挑戰的。本文主要綜述凍存卵巢組織移植安全性以及避免惡性細胞再移回體內新策略的研究進展。

1 卵巢組織凍存與移植概述

2020年，中國新發癌癥患者470萬例，位居世界第一[16]。隨著腫瘤的早發現、早診斷、早治療以及抗癌技術的進步與提高，癌癥患者的5年生存率也明顯提高[17]。因此癌癥幸存者的生活質量以及生育需求越來越得到重視。胚胎凍存、卵母細胞凍存、卵巢組織凍存等是常用的生育力保護技術。相比于胚胎凍存、卵母細胞凍存，卵巢組織凍存不需要超促排卵，不延誤患者后續的治療，一片組織中可凍存成百上千個卵泡，不僅可以保護患者的生育力，還可以保護患者的卵巢內分泌功能[18]。此技術對于青春期前女童和放化療無法延遲的女性來說是唯一的生育力保護技術[2-3]。

通過卵巢組織凍存移植技術，全球首例及第2例嬰兒分別于2004年[19]和2005年[20]誕生。目前全球通過此項技術誕生的嬰兒已超過200例，近期本團隊報道了中國首例患者應用此技術后成功自然妊娠[21]。卵巢組織可移植回卵巢對應的腹膜袋中、剩余的卵巢內、剩余的卵巢上，可實現自然妊娠。如果盆腔經歷大劑量的放射治療(以下簡稱放療)后血管供應差，可考慮上臂、大腿、腹肌處的異位移植，但異位移植的成功率低，可能是環境溫度的不適應。移植的卵巢組織活性平均可持續2～5年，目前報道最長7年[5]。卵巢組織的存活時間與患者凍存時的年齡以及當時的卵巢儲備功能等有關。

成人卵巢組織凍存移植的適應證中最常見的是血液惡性疾病(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病)和乳腺癌[2]。在兒童中，白血病和骨髓增生異常疾病往往占主導地位，其次是肉瘤[22]。到目前為止，還沒有出現與卵巢組織移植相關的復發病例，再次引入惡性細胞的風險很低。因此，卵巢組織凍存移植技術是安全的，在目前的適應證下不會對健康構成威脅。

2 卵巢組織移植再攜入癌細胞的高風險疾病

對于患有白血病、伯基特淋巴瘤等疾病的患者，卵巢組織中存在惡性細胞或者微小殘留疾病(minimal residual disease, MRD)的可能性較高，尤其是在診斷時血液循環中有惡性細胞。多項研究[23-24]也已表明了白血病患者卵巢組織凍存、復蘇與移植攜癌風險很高。但目前卵巢組織凍存仍然是新診斷為白血病的患者保護生育力的主要策略，當患者開始化學藥物治療(以下簡稱化療)后就不能采用胚胎或卵母細胞凍存了，但化療通常需要在診斷后立即開始。相比于凍卵，在化療開始后收集卵巢組織是可能的，因為非生長的卵泡是靜止的，對化療的致畸性損傷不敏感[25]。

已有研究[10]顯示，白血病幸存者可通過卵巢組織移植后分娩且沒有后續疾病復發。卵巢組織取材盡可能是在最安全的時間，一般傾向于完全緩解時。血液系統惡性腫瘤中，在患者對治療出現反應后，以及在疾病負擔或微小殘留疾病已大大減少時收集組織，可將卵巢組織的潛在惡性污染降至最低[26]。在一系列研究中，31例接受了凍融卵巢組織自體移植的患者中有22例(71%)在組織取材前有過化療暴露。自體卵巢組織移植后3年累積妊娠率總計為36%(95%CI為17.4～63.7)，其中49%的患者有過先前的化療暴露，與無先前化療暴露的患者相比差異無統計學意義[27]。當然，即使從完全緩解的患者身上取出用于凍存的卵巢，也不能完全排除攜癌細胞的風險[9, 28]。未來如能有不需要卵巢組織移植而能利用凍存卵巢組織的技術，如始基卵泡的體外成熟[29]以及可移植的人工卵巢[30]，可明顯提高卵巢攜癌風險高的患者的生育力保護。

從凍存的卵巢組織中分離無白血病細胞的未成熟卵泡被認為是可行的。然而，始基卵泡的體外成熟或者它們在人造卵巢中的移植目前還未用于人類，也不能作為自體移植的替代[13]。當白血病幸存者考慮卵巢組織移植時，詳盡的組織評估對于提高移植安全性是必要的[26]。而且，患者需知曉目前檢測技術的局限以及個體權衡想要生物學后代的愿望與疾病復發的風險[25]。

3 避免惡性細胞再移回體內的新策略

全球研究團隊一直致力于開發兩種可安全恢復無法進行卵巢組織移植患者的生殖功能的技術：(1)分離的竇前卵泡以可移植人工卵巢的形式移植回體內生長[30]；(2)分離卵泡的體外生長[29]?；旧?，這兩種技術方法都是將竇前卵泡從卵巢組織中分離出來，然后在體內或體外進行卵泡發育。

3.1 可移植的人工卵巢

人工卵巢是天然卵巢的臨時替代物，分離的卵泡和卵巢基質細胞包裹在生物材料中。主要目標是安全的移植卵巢卵泡，確保性激素的分泌和可受精的成熟卵母細胞的發育。為了設計人工卵巢，最重要的是卵泡。因此，在患者開始癌癥治療之前對卵巢組織進行取材，可進行卵巢組織凍存，也可以用來分離可凍存的竇前卵泡。無論何種卵泡分離方法，均需要鑒定細胞懸液中有無惡性細胞[31-32]。為此，Soares等[33]設計了一種采用重復洗滌過程來清除惡性細胞的特定方案。人工卵巢的第二個組成部分是卵巢細胞，當患者痊愈時，新鮮的間質和內皮細胞可以從癌癥治療后的第二次卵巢取材中收集[34]。也可以分離凍存卵巢組織中的卵巢細胞，但采集新鮮卵巢組織中的卵巢細胞可避免將惡性細胞添加到人造卵巢基質中，而且凍存后的卵巢細胞可能沒有新鮮卵巢組織中的卵巢細胞有活力，雖然化療會損傷卵母細胞的存活和發育，但似乎對卵巢細胞沒有負面影響[15]。卵泡和卵巢細胞將被包裹在一個基質中，基質主要是為了給卵泡提供結構性支持，且便于處理和移植。因此，這3個部分將組成人工卵巢，在癌癥治愈后可移植回患者體內。

生理上，卵巢中所有卵泡周圍有一層特殊的細胞外基質，即基底膜。在成人的卵巢卵泡中，基底膜主要由IV型膠原、層粘連蛋白以及少量的纖維連接蛋白和蛋白多糖組成[35]，在卵泡發育過程中其組成和厚度也在變化[36]?；啄さ拇嬖诳煞乐孤雅荼粣盒约毎廴?。從卵巢組織中應盡可能多的分離出完整卵泡，人原始卵泡和初級卵泡主要分布在卵巢皮質中，其非常致密，富含膠原，安全有效地卵泡分離程序現在對人類應用是可行的，為了獲得高產量和高質量的卵泡，最有效的方法通常依賴于機械和酶組織消化的組合[37]。分離過程中注意保持卵泡基底膜的完整性，可以通過顯微鏡監測。Chiti等[38]優化卵泡分離方案，將卵巢組織消化分成3個時間段(30、60和90 min)，采用的方法為機械法和酶消化法(Liberase DH和DNase I)，并引入過濾以取出已分離的卵泡，然后進一步分離未消化的組織片段，總體上獲得了更高的卵泡產量，移植一周后卵泡恢復率(35%)高于之前的研究(20%)[39]。

早期卵泡發育受卵巢自分泌/旁分泌調節因子的控制，并且已知基質細胞釋放各種正向調節原始卵泡向初級卵泡轉變的因子。在原始卵泡被激活后，初級卵泡分泌其他因子來招募基質細胞分化為功能性膜細胞，這些細胞參與卵泡的生長，并為顆粒細胞合成雌激素提供類固醇合成前體。因此，將卵巢基質細胞添加到人工卵巢中可以重建卵泡和周圍基質細胞之間的交互作用，潛在地促進卵泡發育。血管化也是卵泡存活和生長的關鍵，因此移植后血管發育是必需的[40]。內皮細胞可通過增強移植后的血運重建來促進細胞存活，分離的內皮細胞與基質細胞共移植可促進移植組織的血管化[41]?？傊?，分離的卵巢細胞具有體內增殖、降解支架和合成新的細胞外基質的潛能，使其能夠在人工卵巢中為分離的卵泡提供結構支持。

人工卵巢的支架在植入后應該具有生物相容性和可降解性，以便卵泡能夠發育、遷移、增殖和血管生成[42]。此外，支架材料必須符合生物安全和臨床兼容標準。從廣泛的生物材料中開發合適的支架來包裹卵泡并支持其發育仍然是一個挑戰。在卵泡發育過程中，卵泡從原始卵泡(0.03 mm)到成熟卵泡(18～24 mm)呈指數級增長，需要大量的卵巢細胞和血管來支持卵泡發育。天然的支架材料包括海藻酸鈉、膠原、纖維蛋白、血漿凝塊以及脫細胞卵巢細胞外基質，合成的材料如聚乙二醇[30]。合成聚合物允許為臨床應用量身定做機械性能，但它們不包含細胞黏附所需的分子，盡管可以添加生物活性因子來刺激細胞黏附。相反，天然聚合物含有生物功能分子，顯示出與細胞良好的相互作用，在細胞黏附、遷移、增殖和分化過程中起重要作用[43]。

一種采用小鼠原始卵泡制作的新型3D打印人工卵巢已被證明可用在小鼠身上并成功分娩健康幼崽[44]。目前需要進一步的研究將技術應用于制造人類的人工卵巢并將其應用于臨床實踐。為了更好地應用人工卵巢，需要更深入地了解冷凍保存后卵巢的力學、生物化學特性和卵泡發生，更好的體內成像技術來觀察移植支架的血管化和降解，才能有效地進行臨床應用[43]。

3.2 體外培養

體外培養始基卵泡是另一項新技術，也避免了自體移植攜癌風險高的卵巢組織。凍存的卵巢組織中主要含有原始卵泡，但也提供了從小的竇卵泡中獲得未成熟卵母細胞的可能。因此，在不適合移植的情況下，通過從生長中的卵泡中提取卵母細胞進行體外成熟(in vitro maturation, IVM)，或者通過原始卵泡的完全體外生長(in vitro growth, IVG)和成熟(IVGM)為第二次減數分裂中期(MII)卵母細胞，可以在體外安全地恢復生育力。IVM和IVG方法的發展可以支持卵巢組織中所有階段的卵母細胞，將最大限度地發揮所有接受生育力保護的患者的潛力[45]。但這一領域的進展是謹慎的，要找到最佳的培養基和條件來促進人始基卵泡的高效體外培養是一項艱巨的工作。

IVG和IVGM以及隨后體外受精(in vitro fertilization, IVF)已成功應用在小鼠上并成功分娩其后代[46]。成功的小鼠卵母細胞/卵泡IVG系統的開發突出了對支持人類卵泡IVG的多步培養系統的需求。卵泡發育的每個階段，從原始卵泡激活生長到成熟，都需要不斷變化的條件，因此需要一個動態的培養系統來支持3個主要的過渡步驟：①始基卵泡的激活；②生長卵泡的分離和培養，以實現卵母細胞的生長和發育；③卵泡環境的去除和卵丘卵母細胞復合體的成熟。IVM已成功應用于人類卵母細胞，并取得了不同程度的進展[47-48]。任何IVG系統的終點都是產生具有發育能力和表觀遺傳學正常的卵母細胞；因此，未來的研究需要集中于優化每個階段，并進一步了解IVG卵母細胞和任何形成的胚胎的表觀遺傳學狀態。McLaughlin等[49]已經成功地使人類始基卵泡生長和成熟到竇前、竇卵泡和MII期，提供了證明人類卵母細胞的完全發育可以在體外發生的概念。IVG卵母細胞的形態評價和受精潛力需要進一步優化，以確定其是否正常。不同年齡和青春期成熟階段的卵泡數量差異有統計學意義，青春期前女孩的卵泡在體外表現出與成人不同的生長軌跡[50]，為成人組織開發的培養系統可能不適合青春期前女孩，需要針對特定年齡段調整和完善培養體系。因此，體外培養在臨床應用之前還需要做更多的工作。

4 小結與展望

現在有足夠的證據支持卵巢組織凍存和移植以恢復生育力的可行性和有效性。然而，一些擔憂仍然阻礙了卵巢組織移植在所有患者中的應用。在一些癌癥中，存在將惡性細胞與卵巢組織一起重新移植入體內的風險。近年來，研究人員已經制定了許多策略來解決這些問題。可移植人工卵巢的成功在很大程度上取決于對卵泡發生的生物學機制的理解，以及卵泡與細胞外基質的相互作用以維持和發育合適的卵泡。因此，找到最合適的支架來容納分離的卵泡是至關重要的。另一個關鍵問題是在臨床應用之前，確定分離和移植對人類卵泡是否有表觀遺傳學影響。人工卵巢還有其他重要用途，例如，可以輔助對卵泡發育的理解，以及在毒性學研究中的應用可解釋不同藥物對生殖的影響。它還可以為研究卵原干細胞和評估它們重新啟動人類配子發生的能力提供一個合適的環境。人工卵巢的發展將是生殖組織工程領域的革命性一步。

如果可靠的方法能夠體外產生可受精的成熟的人卵母細胞，這將是一個可行的替代自體卵巢組織移植的方法。除了各種IVG系統的臨床意義和潛力外，它們中的每一個系統都提供了進入人類卵子發生過程的實驗上容易處理的輔助樣本。通過這些系統，我們將更好地了解人類卵母細胞的發育，最終改善生育力的保存。