不同時間低壓低氧刺激對大鼠肺動脈壓力及肺組織的影響

鄧 會 王 勇 陳小蘭 秦 崇 潘 磊*

(1. 首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院呼吸與危重癥醫學科低壓低氧實驗室,北京 100038； 2. 北京急救中心， 北京 100031)

我國幅員遼闊、地形復雜，擁有海拔最高的青藏高原、內蒙古高原等四大高原。隨著海拔升高，空氣壓力逐漸下降，不同的地區和海拔的空氣中氧氣含量也不同[1]，氧氣分壓也會隨高度升高而下降，導致高海拔地區出現低壓低氧環境[2-3]。突然暴露于高原的低壓低氧環境可能會發生急性高原反應，嚴重者可發展為急性腦水腫或急性肺水腫[4-5]，長期暴露于低壓低氧環境可導致慢性高原病，如肺動脈高壓[6-7]等。低氧環境可以刺激血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)的產生，從而促進肺小血管平滑肌細胞、內皮細胞增殖、分化，大量炎癥細胞釋放炎癥因子等，最終導致肺動脈高壓[8]。目前大約超過1.4億人永久居住在海拔2 500米以上的地方，每年有超過3 500萬人前往高海拔地區，包括軍隊、救援人員、鐵路工作人員等[7]，因此了解間斷及持續低壓低氧環境對機體的影響至關重要。前期本課題組模擬高原的特殊環境，已經成功建造了低壓低氧肺動脈高壓大鼠模型[9-11]。本文旨在觀察不同低壓低氧刺激時間對大鼠平均肺動脈壓力、肺組織及酪氨酸激酶中VEGF、PDGF、FGF表達水平的影響，以期為更合理的高原工作時間安排提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究采用Sprague Dawley雄性大鼠，8周齡，體質量約280～320 g，SPF級，共計32只，訂購于北京市維通利華實驗動物技術有限公司。大鼠VEGF ELISA檢測試劑盒，PDGF ELISA檢測試劑盒，FGF ELISA檢測試劑盒均購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1)利用低壓低氧艙構建肺動脈高壓大鼠模型：將32只健康雄性SD大鼠采用抽簽法隨機分為4組：A組正常海拔環境下飼養21 d，B組持續低壓低氧環境21 d，C組每天6 h低壓低氧環境持續21 d，D組隔天24 h低壓低氧環境21 d。先于常壓常氧下適應性喂養3 d后開始實驗。持續低壓低氧條件為：低壓低氧艙內持續減壓到模擬海拔5 000米(條件為大氣壓約50 kPa，氧濃度10%)，艙內溫度、濕度、照明與外界環境相同，每天開艙1 h更換墊料及補充食水。

2) 肺循環血流動力學測定:采用右心導管檢查的方法測定大鼠肺循環血流動力學的參數。各組 SD 大鼠飼養到規定時間，用戊巴比妥鈉( 40 mg /kg) 腹腔注射麻醉，仰臥固定、右側頸部備皮、消毒、切開，分離右頸外靜脈，插入充有 1 mg/mL肝素[0.9%(質量分數)氯化鈉注射液(以下簡稱生理鹽水)]的聚乙烯PE-50右心導管，導管的另一端與 BL-420S 生物信號采集系統(成都泰盟)相連，在壓力波形的引導下，導管經上腔靜脈進入右心房、三尖瓣口、右心室，最后進入肺動脈干，監測壓力變化，并進行采集和記錄。

3)HE染色：分離大鼠左肺下葉組織塊, 常規石蠟包埋, 連續切片(厚5 μm)，將部分切片進行HE染色后光鏡觀察。

4)指標檢測：采用ELISA(酶聯免疫吸附法)檢測大鼠血清中VEGF、PDGF、FGF表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 不同低壓低氧處理時間對大鼠肺動脈壓力的影響

B、C、D組大鼠平均肺動脈壓力較A組大鼠肺動脈平均壓力升高(P<0.05)，其中B組升高最為明顯，平均肺動脈壓力為(27.4±1.2) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。C組和D組平均肺動脈壓力較A組有升高但是均小于25 mmHg，詳見表1。肺動脈壓力波形圖如圖1。

圖1 通過 BL-420S 生物壓力傳感器測定大鼠肺動脈壓力采集圖形Fig.1 The pulmonary artery pressure of rats was measured by BL-420S pressure sensor △1mmHg=0.133 kPa.

表1 通過右心導管法測定大鼠平均肺動脈壓力的數值

2.2 4組大鼠肺組織HE染色

與A組相比，B組大鼠肺血管周圍可見淋巴細胞浸潤，可見肺組織局部實變，亦可見部分肺泡過度充氣；C組少量肺血管周圍可見淋巴細胞浸潤，未見明顯肺組織實變或過度充氣；D組肺血管可見淋巴細胞浸潤，肺組織局部實變。B組肺組織病變較C組和D組明顯(圖2)。

圖2 4組大鼠肺組織病理圖Fig. 2 Pathological changes of lung tissue in four group rats(HE staining,100×) Lymphocyte infiltration can be seen at the black arrow; The yellow triangle was the consolidation lung tissue; The red triangle area was alveolar hyperinflation (the focus of various pathological changes was selected in the visual field);A: Group A; B: Group B; C: Group C; D: Group D.

2.3 4組大鼠血清中VEGF、PDGF、FGF表達量比較

與A組相比，B、C、D組大鼠的VEGF、PDGF、FGF表達量均會出現升高,差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 不同低壓低氧處理時間大鼠血清中VEGF、PDGF、FGF表達量

3 討論

隨著高原鐵路的修建及旅游業發展，越來越多的人生活或工作在高海拔地區(低壓低氧環境)，了解急性或慢性高原病的發生機制及如何更好地適應高原環境對避免急性及慢性高原病的發生具有重要意義。高原的低壓低氧環境可使肺血管內皮細胞功能、代謝和結構發生改變[12]，促使肺血管收縮、重塑，導致肺小動脈產生功能及器質性病變，最終導致肺動脈壓力升高。肺血管重塑不僅表現為肺動脈壁(肺動脈平滑肌細胞、內皮細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞和周細胞)中不同血管細胞的增殖，還表現為毛細血管的丟失和血管周圍過度浸潤炎性細胞(B淋巴細胞和T淋巴細胞、肥大細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等)[13]。既往本團隊成功建立了低壓低氧肺動脈高壓動物模型[9-11]，并且發現低壓低氧肺動脈高壓模型大鼠肺組織可見動脈管壁的增厚、平滑肌細胞增生、炎癥細胞浸潤等[14]。本實驗研究探索了不同低壓低氧處理時間肺組織內炎性細胞的浸潤，肺泡結構的破壞，部分肺血管壁增粗，肺動脈壓力升高情況，為間歇性低壓低氧刺激下肺動脈壓力及肺組織變化提供了理論依據。但由于實驗動物數量較少，測量肺動脈壓力操作技術等多種因素影響，可能會造成一定的實驗誤差。

刺激血管生成的細胞因子包括直接和間接促血管生成。直接促血管生成標志物包括VEGF、FGF和肝細胞生長因子(hepatocyte grouth factor,HGF)，而間接促血管生成標志物包括生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、IL-8和PDGF,VEGF和FGF是血管生成的最強激活因子，可促進血管內皮細胞的遷移和增殖，從而產生和穩定新生血管[8]。研究[15-16]表明，VEGF促進細胞分裂增殖，在各種肺疾病尤其是急性呼吸窘迫綜合征的患者血漿中含量增加。FGF在正常人中有重要的生理功能，如促進傷口愈合、胚胎發育等，但是FGF的過度表達導致血管的異常增殖[17]。有研究[18]曾在肺動脈高壓患兒重塑的肺小動脈上檢測出VEGF和FGF的過度表達。PDGF是一種有效的有絲分裂原，對血管壁細胞如平滑肌細胞(smooth muscle cells,SMCs)具有較強的趨化作用[19]。PDGF信號轉導增加可能參與肺動脈高壓的病理生理學過程[20-21]。既往也有研究[22]表明，FGF和VEGF在低壓低氧環境下表達升高并且與低壓低氧持續刺激時間有關。本實驗也顯示，在受到低壓低氧環境刺激后，VEGF、FGF、PDGF表達量升高，且與平均肺動脈壓力成正比，在今后的實驗中會進一步延長實驗周期，觀察三者動態變化及肺動脈壓力的改變，并且將從細胞水平上觀察肺組織及肺血管的改變。

目前關于長期間斷性往返高原環境工作的人群所發生的病理生理改變的研究甚少, 近年才開始關注這一特殊人群的健康問題[23]。本實驗模擬海拔5 000 m 高度，對不同低壓低氧時間大鼠的平均肺動脈壓力、肺組織改變及血清中VEGF、FGF、PDGF表達量進行探討，結果顯示，每天間斷低壓低氧刺激6 h對大鼠肺動脈壓力及肺組織影響較小，但是仍可見大鼠肺血管周圍有淋巴細胞浸潤，說明誘發了肺內炎癥反應；間斷低壓低氧24 h的大鼠平均肺動脈壓力升高及肺組織改變較前者明顯，但是兩者并未到達肺動脈高壓的診斷標準。血清中VEGF、FGF、PDGF表達量與低壓低氧刺激時間呈正相關，間斷低壓低氧刺激后肺內炎癥改變及大鼠平均肺動脈壓力改變是否可逆，在今后的實驗中筆者會進一步探究，同時也將適當延長實驗周期觀察上述指標的動態變化。該實驗模擬間斷低壓低氧環境刺激，通過不同時長的低壓低氧刺激觀察大鼠一些病理生理指標改變，以期為保證高原作業人員這一特殊人群的身體健康狀況，為設立適當的工作期限或輪班制度提供理論依據。