坐骨神經慢性壓迫損傷動物模型的不同制備方法比較＊

劉柏彤，張 薇，蔣一璐，蔡定均

（成都中醫藥大學針灸推拿學院 成都 610075）

神經病理性疼痛（Neuropathic pain，NPP）是由影響體感神經系統的病變或疾病引起的，主要表現為感覺功能障礙，如自發性疼痛、痛覺過敏、異常疼痛等，在成年人中發病率為6%-8%。神經病理性疼痛與生活質量低下及現有藥物相對保守的療效反應相關。由于其癥狀表現的多樣化及發病機制尚不完全清楚，故為科學研究中的難點之一[1,2]。為了預防和治療NPP，我們需要清楚NPP的發病機制、治療方法及其起效機制。目前研究NPP 最常用的動物模型為中樞疼痛模型、周圍神經損傷模型以及與化療、抗艾滋病治療和糖尿病相關的外周神經痛模型[3]。坐骨神經慢性壓迫損傷（Chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI）模型屬于周圍神經損傷模型，且模型穩定性強，重復性好[4]，故本文選擇CCI模型作為研究對象。坐骨神經走行過程中任何地方的紊亂都可引起坐骨神經痛，最常見的部位是在L4-L5和L5-S1水平，較少出現的是在L3-L4 水平。坐骨神經損傷也會在下盆腔、臀部、臀溝和股二頭肌等部位發生。在不同的研究中，坐骨神經痛的患病率差異很大，最高的發病率為40%，大多數情況發生在40-60 歲[5]。筆者以坐骨神經慢性壓迫損傷動物模型為例，通過結合文獻及筆者的實踐經驗，分析比較不同造模方法的優缺點和適用范圍，以期對CCI動物模型的研究提供指導。

1 動物與制備方法的選擇

1.1 動物選擇

選擇一個合適的載體非常重要，實驗動物的選擇會直接影響到模型成功與否及后續實驗能否順利開展，選擇一個合適的實驗動物可以準確復制出與人類相同或相似的發病機制，對于治療起效機制的研究具有指導意義。因此，首先應考慮如何選擇實驗動物。實驗動物的選擇應該考慮兩個因素，一是種屬，二是性別。實驗動物種屬的選擇還應考慮到動物對造模方法的敏感性、特異性、穩定性及經濟等要素[6]。根據文獻，目前常用來制作CCI 模型的動物有大鼠、小鼠、家兔等。每種動物CCI 模型都具有各自特點：①大鼠性情溫順，生存能力強，體型相對較大，模型成功率較高，是CCI 模型的理想載體。②小鼠生存能力及繁殖力極強，基因組測序表明小鼠與人類平均85%的基因序列高度一致[7]，故小鼠也是CCI 模型較理想的載體。但小鼠體型較小，下肢較細，坐骨神經也較細，不利于觀察研究。③家兔性情溫順，生存能力強，且家兔下肢相對較大，便于模型的制備；但相對于大鼠和小鼠，手術的復雜程度要更高。而動物性別差異同樣也會對CCI 產生影響，如雌性動物的雌激素水平會影響到其對疼痛刺激的敏感性[8]，因此，除特殊研究需要外，應選擇雄性動物。

1.2 制備方法

CCI 動物模型一般與空白組和假手術組相比較。假手術組僅暴露坐骨神經，而不做其他處理。CCI 動物模型的制備方法可以分為兩大類：坐骨神經結扎法和硅膠管環形擠壓法。結扎法易于上手，模型可獲得較高的穩定性；但是缺點在于實際操作中需要準確的手感，若處理不當容易造成模型不成功或坐骨神經損傷。硅膠管環形擠壓法易于操作，且受到外力影響較小，故成功率較結扎法高。但硅膠管存在容易脫落的情況，會影響模型的成功；且在一定程度上會影響模型的熱痛敏和異常性機械痛敏[9]。

此兩種方法在操作難度、模型穩定及成功率等方面各有其特點及優缺點，故應根據實際情況選擇。

2 動物模型制備

2.1 大鼠CCI模型的制備

2.1.1 大鼠坐骨神經結扎法

Bennett 和Xie 的大鼠坐骨神經結扎法[10]是最經典的方法，是將大鼠坐骨神經主干部位鈍性分離出來，用4-0 鉻制羊腸線結扎，每兩道之間間隔約1 mm。大鼠坐骨神經結扎法根據結扎數量不同，又分為兩種方法，分別為結扎3道和結扎4道。

（1）結扎4道

Bennett 等[10]在手術后1-7 天，觀察到大鼠的步態有很大變化，受影響的后爪在行走時笨拙、跛行，在行走或站立時分開的腳趾則會蜷縮，并稍微外翻。大約1周后，跛行有所改善，腳趾蜷縮，外翻明顯，大多數大鼠表現出輕度至中度的足下垂，并持續2個多月，且腳趾蜷縮越來越緊。4-6 周后跛行逐漸改善，但大鼠依然用后爪外翻行走。結扎后第2 天開始，結扎側的后爪機械痛閾明顯降低，術后2個月后仍存在這種現象，但痛覺過敏程度逐漸減弱。至3-4 個月后，后肢出現痛覺減退。何林峰等[11]觀察到模型組大鼠于術后7天，機械痛閾和熱痛閾值表現為降低趨勢，并且持續2周的時間（P＜ 0.01或P＜ 0.05）。

（2）結扎3道

韓光等[12]將大鼠分為假手術組和模型組，觀察到術后1-7天，與假手術組大鼠相比，模型組大鼠機械痛閾和熱痛閾值都顯著降低。術后3天左右的機械痛閾和熱痛閾值下降幅度最大，后逐漸趨于平穩；林志剛等[13]觀察CCI模型組大鼠造模后17天內機械足反射閾值（Paw withdrawal threshold，PWT），發現1、3、5、7、10天PWT 持續下降，于第10 天到達最低水平，于后保持在較平穩水平，與空白組對比具有顯著差異（P＜0.01）；術后第18天觀察到CCI模型組腓腸肌細胞橫截面積明顯小于空白組（P＜0.05）；且術后第18 天觀察到背根神經節的P 物質（substance P，SP）含量較空白組、假手術組明顯升高（P＜ 0.05）

2.1.2 大鼠坐骨神經硅膠管環形擠壓法

經典的神經卡壓損傷模型是Mackinnon 等[14-16]設計的硅膠管卡壓造成的神經慢性損傷模型。是將已消毒的硅膠管（長度為5 mm，管內徑與大鼠坐骨神經直徑基本一致）套住大鼠坐骨神經，并用縫合線將硅膠管固定以環形擠壓坐骨神經。O'Brien 等[16]發現造模3個月時，可見套管處神經受到壓迫，遠端和近端的神經輕微腫脹，套管處神經被觸碰時稍顯緊張，最明顯的是第8個月和第12個月。造模后大鼠第1個月的組織學評估結果為正常，5個月時神經束膜增厚，中央纖維正常，在神經束的頂端可見明顯的脫髓鞘；3個月時，模型組神經傳導速度增加，在5-12個月時，速度和振幅逐漸下降，模型組和對照組間的差異具有統計學意義（P＜ 0.01）。楊書蔚等[17]發現造模后第14 天和28天，與空白組比較，造模大鼠坐骨神經功能指數（Sciatic functional Index，SFI）明顯降低（P＜ 0.01）。造模后第28天各組大鼠坐骨神經病理形態比較：空白組坐骨神經纖維排列整齊，結構緊密，軸索位于神經內膜中間，各結構清晰可見；模型組坐骨神經纖維及髓鞘排列混亂，髓鞘、軸突出現崩解，部分變形呈空泡狀，雪旺細胞增多。

2.2 小鼠CCI模型制備

小鼠坐骨神經結扎法與大鼠坐骨神經結扎法類似，同樣也分為結扎3道和結扎4道。

2.2.1 結扎4道

羅裕輝等[18]發現手術后第4 天模型組小鼠的機械痛閾和熱痛閾值都比假手術組明顯降低（P＜0.05），并一直持續到手術后第6 天。龔華磊等[19]通過測量得到造模前假手術組小鼠手術側、對側和CCI 組小鼠結扎側、對側后爪機械痛閾和熱痛閾值差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后7 天，對比假手術組小鼠手術側、對側和CCI組小鼠結扎側、對側后爪機械痛閾和熱痛閾值。發現與假手術組結扎側比較，CCI 組小鼠患側后爪機械痛閾和熱痛閾值明顯降低（P＜0.05）；造模后7 天，假手術組小鼠手術側、對側和CCI 組小鼠結扎側、對側DRGZHX2 蛋白的表達不同（P＜ 0.05）。與假手術組手術側比較，CCI組小鼠結扎側DRGZHX2蛋白的表達增加2.15倍（P＜ 0.05）。

2.2.2 結扎3道

李永豐等[20]發現CCI 組小鼠痛閾比假手術組顯著降低，術后14天機械痛閾和熱痛閾值均降至最低（P＜0.01）；術后4 天時測得Western blot 結果為損傷區CB1受體的表達水平顯著升高（P＜ 0.01），并于7、11 和14天保持較高水平，與手術前相比有差異（P＜0.05）。楊寧等[21]的實驗中與空白對照組比較，模型組造模后第1、8、22天的痛閾值明顯下降（P＜ 0.05）。

2.3 家兔CCI模型制備

家兔坐骨神經結扎法與大鼠坐骨神經結扎法類似。吳文駿等[22]得到家兔造模3 天后改良Tarlov 評分及趾張反射評分明顯降低，2周后開始恢復，6-8周后，趾張反射及步態基本恢復，針刺反應和外力對抗恢復情況不理想，造模后10 周，家兔各項指標基本達到正常水平。

3 討論

神經病理性疼痛（Neuropathic pain，NPP）占各類慢性疼痛的30%以上，是醫護人員在臨床工作中遇到的常見疼痛類型[23]。不同類型的免疫細胞如肥大細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞等在NPP的發病中發揮重要作用[24]。研究NPP 的重要一步是建立NPP 動物模型，而CCI 模型是研究NPP 的經典模型。在CCI模型中，擠壓神經導致化學促炎物質釋放，以侵襲神經組織，最終導致神經炎和神經肥厚，引起機械痛敏和熱過敏的現象[4]，與NPP 的發病機制相同或類似，具有較高的代表性。目前CCI 模型常用的動物載體有大鼠、小鼠、家兔等；CCI 動物模型的制備最常用的是坐骨神經結扎法和硅膠管環形擠壓法，各具特點。

坐骨神經結扎法較常用。根據筆者的實踐經歷，結扎時應注意，要注意結扎的松緊程度，以免造成造模不成功或損傷坐骨神經，影響機械痛閾和熱痛閾值的結果，甚至造成肢體遠端缺血腫脹，甚至壞死，以致動物啃咬結扎側腳趾。這就需要操作者的大量練習和觀察。從結扎使用的羊腸線到結扎時對手感的把控及對神經外膜血運的觀察，再到結扎完成后對模型的觀察以及相關測量分析，都需要不斷總結經驗。結扎時用的羊腸線需事先在生理鹽水里浸泡，不僅可以防止打結，而且相對于未浸泡的羊腸線，更容易體會結扎的松緊程度；觀察神經外膜血運是最直觀的觀察方式，可觀察到有一條動脈和一條靜脈伴行，靜脈肉眼隱約可見；動脈則需用體視顯微鏡觀察。結扎完畢將大鼠下肢靜置幾分鐘，若靜脈變得比較清晰則表明結扎松緊度合適；如有充血現象，則表明結太緊了[9]。家兔和大鼠的坐骨神經較粗，結扎相對容易；而小鼠的坐骨神經較細，在結扎中應注意避免造成坐骨神經的損傷。筆者在搜集文獻時發現結扎法在大鼠和小鼠模型中運用時都分為結扎3 道和結扎4 道，根據文獻反饋的結果來看，結扎3 道和結扎4 道均可制備出較滿意的CCI 模型，兩種方法對于造模結果無顯著差別；但結扎4 道對于動物行為學的影響比結扎3 道久，更適用于長期觀察。

硅膠管環形擠壓法中硅膠管本身直徑固定且無彈性，故不存在外力影響壓迫效果的情況；但硅膠管相對于結扎用的腸線體型較大，產生炎性疼痛的可能性增大，在一定程度上會影響模型的熱痛敏和異常性機械痛敏，且容易出現脫落和半脫落的情況。這需要操作者在制備模型時考慮到硅膠管的固定問題，同時又不能對硅膠管產生外力以影響模型的復制。筆者搜集到僅有大鼠采用此方法制備CCI 模型，小鼠沒有采用此方法或許與其坐骨神經太細太短，沒有相配套的硅膠管有關；而家兔的CCI 模型在搜集資料時得到的文獻較少，還欠缺相關研究。但是根據目前搜集到的文獻，家兔坐骨神經結扎后10 周各項指標基本恢復[22]，與家兔的恢復能力強有關，所以家兔的坐骨神經結扎模型不利于時間跨度較大的實驗。

根據已有文獻，坐骨神經結扎法造模后大鼠會出現足外翻或蜷縮的現象，在一定程度上會影響熱痛閾的測量，而采用硅膠管環形擠壓法造模的大鼠足印長度（Print length，PL）、中間足趾距離（Inter-toes distance，IT）增長[25]，對于熱痛閾測量的影響相對小。坐骨神經結扎大鼠于術后第1天即可出現機械痛閾和熱痛閾值降低等行為學改變，且具有統計學意義；就目前收集到的文獻，采用硅膠管環形擠壓法制備的CCI 模型大鼠最早于第9 天可觀察到有行為學的改變[25]，較之坐骨神經結扎的大鼠更晚；但坐骨神經結扎的大鼠于3-4 個月后，后肢出現痛覺減退[10]；而硅膠管環形擠壓坐骨神經的大鼠痛覺過敏可持續至12 個月[25]。故坐骨神經結扎法適用于CCI 大鼠疼痛模型急性期觀察，而硅膠管環形壓迫法適用于長期及慢性疾病觀察和研究。但是采用坐骨神經結扎法制備的動物模型存在“自噬”現象，容易產生組織破壞和感染，影響觀察結果。王金保等[26]改良了這種方法，先用多孔膠片包裹需結扎的部位，再行用羊腸線結扎，減少了動物的“自噬”現象，但運用此方法的后續報道較少，這種方法與傳統方法是否存在差異目前尚不清楚。硅膠管環形擠壓法制備的動物模型未看到動物被報道出現“自噬”現象，可有效減少其他因素的干擾。

坐骨神經損傷常由腰骶部脊柱疾病、椎管內病變、腰骶軟組織勞損引起，臨床以椎間盤突出、梨狀肌綜合征引起者最為多見。目前制備CCI模型的大鼠均在大鼠大腿外側將大鼠坐骨神經主干部分分離出來，或用羊腸線結扎，或用硅膠管固定環形擠壓，其作用機理和表現與梨狀肌綜合征更為相似。梨狀肌綜合征急性期，患者在臀部或腰骶部感覺到沿坐骨神經的放射性疼痛，下肢不能伸直，步履跛行[27,28]。這種臨床表現與采用坐骨神經結扎法制備CCI模型的大鼠出現的縮足、跛行甚至足外翻，痛覺過敏持續2個月后逐漸消失[10]的表現相似。而梨狀肌綜合征慢性期患者則表現出小腿外側的疼痛、麻木、乏力等癥狀，甚至出現足下垂的表現[28,29]。采用硅膠管環形擠壓法制備出的CCI 模型大鼠會有PL、IT 增長的表現，且造模后的熱痛閾和機械痛閾自第9 天開始趨于穩定，癥狀可持續12 個月[25]，都與梨狀肌綜合征慢性期患者的臨床表現相似。但是坐骨神經結扎法制備CCI 模型的大鼠于3-4 個月患肢會出現痛覺減退[10]，也與慢性梨狀肌綜合征患者臨床表現相似，只是目前文獻關于長期觀察這種方法制備CCI大鼠的記錄較少、癥狀描述較少，故無法對應。而且目前對于CCI 模型評價方法較單一，一般僅觀測熱痛閾和機械痛閾的改變，但是臨床上坐骨神經痛患者的臨床表現更多樣，這也是后續實驗需要完善的地方。

總之，研究NPP 的重要基礎首先就是要建立起滿意的NPP 動物模型，模型的建立也可以保證研究結果的準確性。目前復制CCI 動物模型的方法經典且成熟，但是某些動物的造模方法過于單一，且不能完全模擬人的發病機制，而且在實際操作中遇到一些無法標準化和模型評價標準欠完善的問題，仍需我們繼續探索和創新。