非靶標和靶標代謝組學技術在肺癌診斷血清標志物篩選中的應用

鄭巍亮 余江清▲ 杜 芬 謝寶剛 賀祥源

1.江西省景德鎮市第一人民醫院呼吸內科，江西景德鎮 333000；2.南昌大學藥學院，江西南昌 330006；3.南昌大學第一附屬醫院胸外科，江西南昌 330006

肺癌是一種非特異性疾病，很難與其他肺部疾病區分開來，采取安全、有效的早期診斷方法，可使患者平均生存期從5年以上的15%增加到85%[1-2]。目前發現，低劑量螺旋CT 對早期肺癌的檢出率較低，其假陽性結果可能會導致過度診斷[3-4]。隨著現代分子生物學的全面發展，許多新的腫瘤標志物對惡性腫瘤的早期診斷及篩查具有重要臨床價值，而目前常規腫瘤標志物對肺癌早期診斷缺乏敏感度與特異性。代謝組學是一種新興的組學技術，研究對象主要為小分子的代謝物（1000 kb 以下），從代謝物水平反應機體發生的一系列微小變化，適合于疾病的診斷研究[5]。代謝組學技術已被廣泛的應用于肺癌的研究，已有眾多學者利用多種檢測技術對肺癌的診斷、治療預測展開了相關研究，并獲得優異的研究成果[6-10]。本研究通過核磁共振氫譜（1HNMR）非靶標技術對肺癌組織和正常肺組織相關的差異代謝物進行分析，再次通過利用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）靶標技術檢測肺癌患者、健康人群血清中相關代謝物進行定量分析，篩選對肺癌診斷較好的代謝物組，為肺癌早期診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年7月～2018年12月47例術后肺癌組織及正常肺組織標本，30例腺癌患者中男22例，女8例；年齡44～73歲，平均（58.5±11.5）歲；17例鱗癌患者中男15例，女2例；年齡46～72歲，平均（60.3±8.5）歲；基于國際抗癌聯盟（UICC）第八版肺癌TNM分期，Ⅰ期18例，Ⅱ期22例，ⅢA 期7例；有吸煙史者35例。收集143例經病理確診的肺癌患者（肺癌組）血清及99例健康體檢者（正常對照組）的血清標本。肺癌組男102例，女41例；年齡39～86歲，平均（62.5±15.2）歲；腺癌69例，鱗癌52例，小細胞癌22例；TNM分期Ⅰ期25例，Ⅱ期42例，Ⅲ期52例，Ⅳ期24例；有吸煙史者105例。肺癌患者納入標準：①血液標本為早晨9 時采集的；②無糖尿病及其他代謝疾病和長期服藥史；③入選前未接受任何抗腫瘤治療且不合并其他腫瘤，功能狀態評分（PS）＜2分。標本均來自南昌大學第一附屬醫院胸外科及景德鎮市第一人民醫院呼吸內科，收集后于-80℃冷凍保存。本研究得到這兩所醫院醫學倫理委員會批準，并取得患者的知情同意書。

1.2 肺癌組織標本處理

冷凍保存的肺癌組織及正常組織取出后室溫解凍，吸除標本表面多余的水分，精密稱取0.1 g 組織置于勻漿器，3 ml 的勻漿液（80%甲醇）分3次加入勻漿器中，提取的勻漿液匯總于5 ml 的EP 管中，1000 r/min離心10 min后取1 ml 上清液于EP 管中，EP 管置于真空旋轉蒸發儀中烘干。烘干物用蒸餾水460 μl 復溶，取上清液445 μl 與磷酸緩沖液50 μl、三甲基甲硅烷基丙酸鈉鹽溶液（重水）50 μl 混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液500 μl 于核磁管中，行1HNMR 檢測。

1.3 肺癌血清標本處理

將收集的所有血清標本于-80℃冰箱中取出，室溫解凍。取血清樣品50 μl 與30 μl 同位素標記的膽堿溶液（乙酸銨溶液）、30 μl 的80%乙腈和340 μl乙腈均勻混合，后于12 000 r/min 離心5 min，取上清200 μl 進行膽堿類物質的檢測。取30 μl 血清樣品與30 μl 內標溶液、30 μl 乙酸銨溶液、30 μl 的80%乙腈、和330 μl 乙腈均勻混合以沉淀蛋白，同理，超聲和離心后取上清進行嘌呤類物質的檢測。

1.4 標本中代謝物測定

1.4.1 膽堿類標準品的配置 甜菜堿、胱硫醚、二甲基甘氨酸、乙酰肉堿、乙酰膽堿、肉堿、肌酐、膽堿和S-腺苷甲硫氨酸等物質分別用水溶解配成母液。取100 μl各母液混勻，依次進行二倍稀釋。取50 μl 各濃度的稀釋液與30 μl 乙酸銨溶液配制的內標溶液、30 μl 80%乙腈溶液和340 μl 乙腈進行沉淀蛋白、超聲和離心后進樣。

1.4.2 嘌呤類標準品的配置 尿苷、黃嘌呤、鳥苷、肌苷、腺苷、鳥嘌呤、尿酸、黃嘌呤核苷、次黃嘌呤和腺嘌呤分別用2 ml 的NaOH 溶液（0.1 mol/L）溶解，甲醇稀釋成一定濃度的母液。各母液吸取適量均勻混合，使各物質的濃度為20.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5 μg/ml，后續濃度依次2倍稀釋。取30 μl 不同濃度梯度的稀釋液與30 μl 乙酸銨溶液、30 μl 內標溶液、30 μl 牛血清白蛋白溶液和330 μl 乙腈進行膽堿樣標準品操作。

1.4.3 靶標代謝組學的檢測方法 采用多重反應監測模式（MRM），正離子檢測；電噴霧毛細管電壓設定為3.0 kV，干燥氣（氮氣）流速為50 L/h；離子源溫度為100℃，色譜柱溫度為40℃，自動進樣器溫度為20℃；采用ACOQUITY UPLC BEH HILIC 色譜柱（2.1 mm×100 mm，7 μm；Waters，USA）；10 mmol/L 0.01%乙 酸銨（A）-乙腈（B）作為流動相，流速為0.3 ml/min。

1.5 統計學方法

1HNMR 的數據利用網絡數據庫、統計全相關譜（STCOSY）、2 維全相關譜（TCOSY）及標準品比對等方法進行代謝物鑒定，主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）進行相關統計分析，變量重要性（VIP）值聯合P 值得到差異代謝物。UPLC-MS/MS 的數據導入SPSS 22.0 統計學軟件，采用受試者工作特征（ROC）曲線評價各代謝物的診斷性能，獨立樣本t 檢驗篩選差異代謝物，差異代謝物建立Logistic回歸模型，確定診斷價值高的代謝物組合。

2 結果

2.1 肺癌組織與正常肺組織的PCA與PLS-DA分析

肺癌組織和正常肺組織的1HNMR 數據PCA 得分見圖1A（封三），肺癌組織與正常肺組織兩個群組之間的代謝物比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。肺癌組織與正常肺組織的PLS-DA 模型（R2X=0.424，R2Y=0.834，Q2=0.778）的得分見圖1B（封三），兩組區分結果幾乎不存在重疊情況，二者可以有效分開。進行200次置換檢驗來檢驗所建的模型，置換檢驗后的R2截距為0.218，Q2截距為-0.0622，本模型有效（圖1C，封三）。

圖1 肺癌及正常肺組織的PCA、PLS-DA 及200次置換驗證分析結果

2.2 篩選肺癌組織與正常肺組織間的差異代謝物

對明確鑒定的且VIP 值＞1 的13種代謝物積分，脂質、乳酸和甜菜堿為肺癌組織與正常肺組織相關的差異代謝物（P＜0.05）。肺癌組織中脂質、亮氨酸、纈氨酸、3-羥基丁酸、琥珀酸、膽堿、葡萄糖、甜菜堿、甘氨酸、乳酸和甲酸的含量高于正常肺組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；醋酸的含量低于正常肺組織，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 基于1HNMR 數據進行肺癌和正常肺組織分類的代謝物信息（ng/ml，±s）

表1 基于1HNMR 數據進行肺癌和正常肺組織分類的代謝物信息（ng/ml，±s）

代謝物 肺癌組織（n=47）正常肺組織（n=47） VIP 值 P 值脂質亮氨酸纈氨酸3-羥基丁酸丙氨酸醋酸琥珀酸膽堿葡萄糖甜菜堿甘氨酸乳酸甲酸6.94±0.59 48.98±2.51 25.58±1.89 46.36±4.59 113.69±3.92 109.89±6.77 31.66±2.17 22.01±1.22 527.75±33.41 207.58±8.71 35.42±2.45 146.84±8.33 14.37±0.94 1.69±0.08 39.39±1.85 19.01±2.11 18.92±1.04 123.01±4.93 195.00±5.31 16.96±0.63 16.16±0.98 276.25±7.69 123.81±2.39 26.56±1.57 74.99±5.11 4.55±0.24 1.24 1.62 2.37 3.15 3.23 3.94 1.02 1.73 2.81 1.48 1.56 3.11 1.84 0.000 0.002 0.026 0.000 0.143 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.002 0.000 0.000

2.3 肺癌和健康組膽堿和嘌呤類代謝物定量分析

基于1HNMR 非靶標代謝組學研究結果，發現有利于診斷的差異代謝物與膽堿及嘌呤代謝通路密切相關，兩者通路上的物質均參與一碳代謝和甲基化。肺癌組血清中黃嘌呤、黃嘌呤核苷、鳥苷、次黃嘌呤和乙酰膽堿的含量高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而血清中尿苷、腺嘌呤、腺苷、鳥嘌呤、尿酸、肌苷、膽堿、甜菜堿、肉堿、肌酐、二甲基甘氨酸、乙酰肉堿和胱硫醚含量低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中黃嘌呤核苷、尿苷、鳥苷、腺嘌呤、腺苷、鳥嘌呤、尿酸、肌苷、膽堿、肉堿、肌酐、二甲基甘氨酸、乙酰肉堿、胱硫醚的組間差異有顯著統計學意義（P＜0.01），甜菜堿與黃嘌呤的組間差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 UPLC-MS/MS 定量檢測血清代謝物水平

2.4 差異代謝物對肺癌患者和健康人群的鑒別診斷效能分析

黃嘌呤核苷、鳥苷、尿酸、肌苷和胱硫醚對肺癌有較好的診斷價值（AUC＞0.8）（表3）。

表3 量化代謝指標的ROC 分析結果

2.5 肺癌患者和健康組鑒別診斷的Logistic回歸分析

將找出的差異代謝物進行二元向前Wald 的Logistic回歸分析，胱硫醚、鳥苷、尿酸和腺嘌呤聯合的標志物組合會提高診斷性能，建立的模型方程為Y=10.774+3.891×X1+0.527×X2-0.001×X3-0.028×X4（X1：鳥苷的濃度；X2：腺嘌呤的濃度；X3：尿酸的濃度；X4：胱硫醚的濃度），AUC 為0.993，分類準確度為93.0%，敏感度和特異性分別是92.4%和100.0%，ROC曲線見圖2。

圖2 組合變量進行肺癌診斷的ROC曲線

3 討論

早期篩查已成為肺癌防治的關鍵，目前臨床應用的癌胚抗原、神經元特異性烯醇化酶、鱗狀細胞抗原及細胞角蛋白19 片斷抗原對肺癌早期診斷價值有限，探索診斷肺癌特異性強、敏感性高的生物標志物成為臨床研究的熱點。

本研究利用1HNMR 非靶標代謝組學技術結果顯示：肺癌組織中脂質、亮氨酸、纈氨酸、3-羥基丁酸、琥珀酸、膽堿、葡萄糖、甜菜堿、甘氨酸、乳酸和甲酸的含量高于正常肺組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；醋酸的含量低于正常肺組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；與前人研究結果一致[11]。肺癌組織中乳酸、3-羥基丁酸水平的上升，可能與癌癥本身能量代謝密切相關，腫瘤組織出現有氧呼吸減慢，無氧酵解增強有關[12-13]。

由于血液是容易獲取的生物標本，本研究對肺癌患者血液中代謝物進行研究，考察肺癌組織代謝產物與血液中代謝物變化相關性，對肺癌的診斷具有重要意義。腫瘤組織作為肺癌直接病變部位，其代謝產物能更好展現癌癥的狀態。首先以肺癌組織為研究標本，利用非靶標代謝組學方法對其代謝物測定，然后再用靶標代謝組學方法對血清中代謝物進行研究。結果顯示：肺癌組血清中黃嘌呤、黃嘌呤核苷、鳥苷、次黃嘌呤和乙酰膽堿的含量高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而血清中尿苷、腺嘌呤、腺苷、鳥嘌呤、尿酸、肌苷、膽堿、甜菜堿、肉堿、肌酐、二甲基甘氨酸、乙酰肉堿和胱硫醚含量低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。肺癌患者血清乙酰膽堿含量升高，可能與膽堿乙酰化酶的活性增加或膽堿酯酶的活性下降有關[14]。肺癌患者較正常對照組血清次黃嘌呤、鳥苷含量明顯升高，然而鳥嘌呤、肌苷含量顯著下降，或許是因為嘌呤核苷磷酸化酶的活性增加，也可能是因為鳥嘌呤脫氨酶及次黃嘌呤核苷酸脫氫酶活性增加，促進其合成[15-16]。

另外發現，肺癌患者的血清胱硫醚含量降低，這可能與分解胱硫醚的胱硫醚-β-裂解酶活性升高或胱硫醚-β-合酶的活性降低密切相關。然而肺癌患者血清尿酸的含量下降可能是由于排泄出現障礙、重吸收的尿酸減少，一定水平的尿酸可以抗氧化、清除自由基、增強免疫、降低患癌的風險[17-19]。血清中的甜菜堿與膽堿含量降低可能與合成減少明顯有關[20]。

通過非靶標UPLC-MS/MS 定量結果顯示的兩組差異有統計學意義的指標作為因變量，經二元Logistic回歸分析，聯合測定血清代謝物胱硫醚、鳥苷、尿酸和腺嘌呤為最佳生物標志物組合，AUC 為0.993，敏感度和特異度均大于85%。為肺癌的早期診斷提供參考。

然而，本研究也存在以下缺陷：①臨床研究樣本量偏小；②代謝組學結果沒有與肺癌患者驅動基因及免疫狀態進行相關研究。鑒于此，本研究后期加大肺癌臨床樣品量，增加代謝物篩選量，以找到更好的代謝物，為肺癌早期診斷提供新的方法。并將繼續探討肺癌代謝組學與基因組學-轉錄組學-蛋白質組學的相關性，為肺癌精準治療提供新的方向。