枳殼揮發(fā)油抑菌活性的譜效關(guān)系

張智敏 闞雨村江豪杰李亞梅 嚴(yán)建業(yè)林麗美*羅 堃*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,湖南 長沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評價湖南省重點實驗室/湖南省中藥不良成分快速檢測及脫除工程技術(shù)研究中心,湖南 長沙 410208)

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的未成熟果實,有效成分主要為生物堿、黃酮、揮發(fā)油,具有破氣消積、化痰散痞的功效[1],其中揮發(fā)油是枳殼理氣、行滯、鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌等作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。以往文獻(xiàn)對枳殼揮發(fā)油的研究主要集中在化學(xué)成分[3],較少涉及抑菌活性[4-5]。

中藥成分復(fù)雜多樣,生物活性往往是多種成分作用于多靶點的整體結(jié)果。植物揮發(fā)油的抑菌活性也是由其成分組成決定的[6],而且不一定主要化合物[7],并通過協(xié)同或拮抗作用發(fā)揮效果[8-9]。

譜效關(guān)系是一種將化學(xué)特征鑒別與生物活性評價整合為一體的綜合性評價模式[10-12],對于成分復(fù)雜且有效成分不明確的中藥而言,是明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、評價其質(zhì)量的重要手段。其中,偏最小二乘回歸法集合了多元線性回歸、主成分分析和典型相關(guān)分析的優(yōu)點,可較好地揭示各色譜峰與藥效指標(biāo)間的相關(guān)性[13-14]；雙變量相關(guān)分析[15]是一種研究兩個變量之間相互關(guān)系的統(tǒng)計學(xué)方法,以相關(guān)系數(shù)的大小及方向反映藥效指標(biāo)與色譜峰關(guān)系的密切程度及正負(fù)關(guān)系。

因此,本實驗采用GC-MS 法分析枳殼揮發(fā)油化學(xué)成分,通過偏最小二乘回歸法、雙變量相關(guān)分析篩選并確定其抑菌化合物,從分子化學(xué)水平闡明其物質(zhì)基礎(chǔ),為尋求不良反應(yīng)較小的天然中藥相關(guān)活性成分提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 12 批枳殼經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實,具體信息見表1。氨芐西林[批號A100339-0005,生工生物工程(上海) 股份有限公司]；硫酸慶大霉素碳酸鉍(山西云鵬制藥有限公司)。乙酸乙酯、DMSO (二甲基亞砜)、無水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

表1 樣品信息

1.2 菌株 金黃色葡萄球菌ATCC26003、大腸桿菌ATCC44138、沙門氏菌ATCC50115、表皮葡萄球菌(廣東省微生物菌種保藏中心)。

1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號140720,杭州濱河生物試劑有限公司)；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號130730,杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.4 儀器 GC-MS-QP2010 型色譜儀(日本Shimadzu 公司)；JK-G-522B3 型高速萬能粉碎機(jī)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；DZTW 型調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；揮發(fā)油提取裝置(成都蜀牛科技有限公司)；SW-CJ-2FD 型凈化工作臺(南京迅達(dá)空氣技術(shù)有限公司)；LDZM-60KCS 型高壓蒸汽滅菌鍋(上海永安醫(yī)療器械廠)；DH-400AB 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(成都致力儀器有限公司)；ZHWY-200D 型恒溫振蕩器(上海智仁分析儀器制造有限公司)；DEN-1 型麥?zhǔn)媳葷醿x(英國格蘭特儀器公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品制備 參照2015 年版《中國藥典》 進(jìn)行。

2.2 揮發(fā)油提取 將生品和炮制品粉碎后過40 目篩,各取1 kg 粉末,置于10 000 mL 圓底燒瓶中,加入蒸餾水浸泡過夜,安裝揮發(fā)油提取裝置,參考2015 年版《中國藥典》 四部通則2204 揮發(fā)油測定法提取枳殼揮發(fā)油,經(jīng)無水Na2SO4干燥后封裝備用。

2.3 抑菌活性檢測

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取氨芐西林粉末500 mg,無菌水定容至5 mL,得100 mg/mL 貯備液,精密吸取200 μL,無菌水稀釋至100 mL,即得200 μg/mL 相應(yīng)陽性對照品溶液；精密稱取硫酸慶大霉素碳酸鉍0.3 g (每0.6 g 含40 mg 慶大霉素),無菌水稀釋至100 mL,即得200 μg/mL相應(yīng)陽性對照品溶液。

2.3.2 菌懸液制備 將實驗用菌種接種于營養(yǎng)瓊脂平板上,37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h 后,挑選特征菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃搖床培養(yǎng)12 h 后采用麥?zhǔn)媳葷岱?無菌生理鹽水將其稀釋至0.5 麥?zhǔn)媳葷釂挝?即1.5×108CFU/mL。

2.3.3 抑菌圈測定 采用濾紙片法[16]。取揮發(fā)油1 mL,0.22 μm 微孔濾膜過濾。將藥敏空白濾紙片置于潔凈干燥的培養(yǎng)皿中,干熱滅菌后加到揮發(fā)油中浸泡過夜,臨用前用無菌鑷子將紙片置管口干燥0.5 h。取20 mL 熔化后的營養(yǎng)瓊脂倒入9 cm 平板,待其凝固后吸取200 μL 菌液,均勻涂布于凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上,在每個含菌平皿呈正三角放入3 張含上述同種藥液的濾紙片,以氨芐西林為革蘭氏陽性菌的陽性對照,慶大霉素為革蘭氏陰性菌的陽性對照,無菌水為陰性對照,37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h 后取出,游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑,計算抑菌系數(shù)[17](樣品的抑菌圈直徑/陽性對照的抑菌圈直徑),結(jié)果見表2。

由此可知,生品、炮制品均對革蘭氏陽性菌的抑制效果更強(qiáng),這是因為揮發(fā)油是通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜而發(fā)揮這樣[18],而革蘭氏陽性菌、陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)明顯不同,使前者對揮發(fā)油成分的敏感性通常比后者更明顯[7,19-20]；但沙門氏菌是個特例,由于它具有不同的細(xì)胞靶標(biāo),可通過多種形式特異性結(jié)合揮發(fā)油中不同成分,導(dǎo)致可能比某些革蘭氏陽性菌更加敏感[21-22]。

表2 揮發(fā)油抑菌圈測定結(jié)果（，n=3）

表2 揮發(fā)油抑菌圈測定結(jié)果（，n=3）

2.4 GC-MS 指紋圖譜建立

2.4.1 供試品溶液制備 精密吸取“2.2” 項下?lián)]發(fā)油200 μL,乙酸乙酯定容至5 mL,過0.22 μm 微孔濾膜,即得,冷藏備用。

2.4.2 GC-MS 分析 參考文獻(xiàn)[5]報道。

2.4.2.1 GC HP-5MS 石英毛細(xì)管柱(5% Phenyl Methyl Silox,0.25 μm×0.25 mm×30 m)；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣氦氣,體積流量1.0 mL/min；分流比10∶1；進(jìn)樣量1 μL；程序升溫(柱溫60 ℃,保持3 min,2 ℃/min 升至80 ℃,5 ℃/min 升 至120 ℃,2 ℃/min 升至160 ℃,15 ℃/min 升至260 ℃,保持10 min)。

2.4.2.2 MS 電離方式EI；電子轟擊能70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；接口溫度260 ℃；質(zhì)量范圍m/z 50～400。

2.4.3 方法學(xué)考察 對上述實驗條件進(jìn)行方法學(xué)考察,發(fā)現(xiàn)儀器精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好,回收率RSD 均小于3.0%。

2.5 譜效關(guān)系分析

2.5.1 GC-MS 指紋圖譜建立 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A 版” 軟件,對16 批樣品的GC-MS指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以S4 為參照,經(jīng)過多點校正、自動匹配后生成對照指紋圖譜(圖1),確定了12 個共有峰。經(jīng)過質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索(NIST05.LIB、NIST05 s.LIB 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫) 與CAS 號查詢,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和各項分析鑒定確定其成分,峰面積歸一化法計算各成分相對含有量,結(jié)果見表3。

圖1 揮發(fā)油對照指紋圖譜

由此可知,炮制前后共鑒定出12 種主要成分,分別占生品、炮制品揮發(fā)油總量的98.67%、97.55%；相對含有量較高的為D-檸檬烯、γ-萜品烯、芳樟醇、大根香葉烯D,在生品、炮制品揮發(fā)油中分別占 84.99%、6.57%、2.66%、1.39%,80.94%、7.44%、3.96%、1.95%。炮制前后揮發(fā)油總量及組成發(fā)生了變化,可能是由于麥麩與藥材共同加熱時可吸收部分揮發(fā)油,使其含有量降低,并改變了各組分間的比例[23]。

2.5.2 抑菌活性譜效分析 采用SPSS 17.0 軟件,以抑菌圈直徑為變量Y,色譜峰面積為變量X 進(jìn)行相關(guān)分析,建立生品、炮制品共有峰峰面積與其藥效學(xué)的Pearson 相關(guān)系數(shù),見表4。再采用SIMCA 13.0 軟件進(jìn)行偏最小二乘回歸法(PLSR) 分析,建立生品、炮制品對試驗菌的譜效關(guān)系模型,發(fā)現(xiàn)生品對沙門氏菌,炮制品對金黃色葡萄球菌的建模效果較好,標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)圖和VIP 圖見圖2～3。

表3 共有峰成分鑒定及其相對含有量

表4 共有峰峰面積與抑菌圈直徑的Pearson 相關(guān)系數(shù)

在偏最小二乘法中,回歸系數(shù)絕對值反映色譜峰對抑菌圈直徑的貢獻(xiàn)程度,其數(shù)值越大,貢獻(xiàn)越大；回歸系數(shù)的符號反映與抑菌圈直徑的相關(guān)性,由于抑菌圈直徑與藥效呈正相關(guān),故回歸系數(shù)為正的色譜峰是對揮發(fā)油抑菌活性有貢獻(xiàn)者。變量重要性值(VIP) 可評價自變量對因變量解釋的重要程度[24],當(dāng)VIP ＞1 時,說明自變量是重要的。

結(jié)合雙變量相關(guān)分析結(jié)果可知,生品揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑制作用主要是由6、7 號色譜峰所代表的γ-萜品烯、4-蒈烯含有量決定,對表皮葡萄球菌的抑制作用主要是由2、6、11、7 號色譜峰所代表的β-蒎烯、γ-萜品烯、大根香葉烯D、4-蒈烯含有量決定,對大腸桿菌的抑制作用主要是由12、4 號色譜峰所代表的棕櫚酸甲酯、D-檸檬烯含有量決定,對沙門氏菌的抑制作用主要是由6、7 號色譜峰所代表的γ-萜品烯、4-蒈烯含有量決定；炮制品揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑制作用主要是由5、8 號色譜峰所代表的β-羅勒烯、芳樟醇含有量決定,對表皮葡萄球菌的抑制作用主要是由7 號色譜峰所代表的4-蒈烯含有量決定,對大腸桿菌的抑制作用主要是由4、1 號色譜峰所代表的D-檸檬烯、α-蒎烯含有量決定,對沙門氏菌的抑制作用主要是由2、9 號色譜峰所代表的β-蒎烯、α-萜品醇含有量決定。

3 討論

圖2 生品PLSR 標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)和VIP 值

圖3 炮制品PLSR 標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)和VIP 值

文獻(xiàn)報道,α-萜品醇、γ-萜品烯是揮發(fā)油中的強(qiáng)力抑菌成分[25],其中前者可抑制大腸桿菌、表皮葡萄球菌、白色念珠球菌等微生物的生長[7]；4-蒈烯被證實對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、白色念珠菌均有抑制活性[26]；芳樟醇具有廣譜抗細(xì)菌、真菌活性[27]；α-蒎烯、2-β-蒎烯、檸檬烯也有較強(qiáng)的抗細(xì)菌活性[28],這些成分通過破壞細(xì)菌或真菌細(xì)胞膜的完整性,從而對上述微生物發(fā)揮毒性作用[29]。Guo 等[30]分析國內(nèi)栽培的幾種主要柑橘類品種中揮發(fā)油抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)β-蒎烯、芳樟醇對多種微生物具有顯著作用,α-蒎烯對乙型副傷寒沙門氏菌有一定效果。一些研究證明,檸檬烯具有殺菌、抗氧化等活性[31],但該成分容易氧化,而且難溶于水,導(dǎo)致其活性降低,故在高劑量下可能不會產(chǎn)生高抗菌活性,但如果將其與乳化劑或者其他天然抑菌成分組合時,則可在低劑量下即有顯著抑菌活性[32]。Haber 等[33]指出,揮發(fā)油主要成分大根香葉烯D 對蠟樣芽孢菌、金黃色葡萄球菌[34]、大腸桿菌、銅綠假單胞菌均有抑制作用,而羅勒烯可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌,尤其是表皮葡萄球菌的生長[35]。另外,棕櫚酸甲酯也被證實具有抑菌活性[36]。以上發(fā)現(xiàn)均對本實驗起到了重要的支撐作用。

本實驗先通過GC-MS 法獲得枳殼揮發(fā)油指紋圖譜,濾紙片法得到其對4 種細(xì)菌的抑菌效果,然后采用PLSR、雙變量相關(guān)分析揭示了其譜效關(guān)系,發(fā)現(xiàn)對枳殼揮發(fā)油抑菌活性貢獻(xiàn)較大的成分主要為芳樟醇、α-萜品醇、D-檸檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、γ-萜品烯、4-蒈烯、大根香葉烯D、β-羅勒烯和棕櫚酸甲酯,并通過協(xié)同作用發(fā)揮效果。今后,將進(jìn)一步分離枳殼揮發(fā)油藥效成分,分析其單體及多種成分通過協(xié)同/敵對作用在體外的抑菌活性,以及共有峰之外的色譜峰是否與其抑菌活性相關(guān)。

綜上所述,本實驗初步探討了枳殼揮發(fā)油發(fā)揮抑菌作用的主要有效成分,為解決細(xì)菌對抗生素的耐藥性,尋求不良反應(yīng)較小的天然中藥香港活性成分提供依據(jù),同時也為中藥譜效關(guān)系分析提供參考。