敦煌平胃丸對人胃癌細胞株SCG-7901 裸鼠移植瘤的抑制作用

李亞玲 董娟娟李俊杰劉永琦 展文華舍雅莉*

(1.甘肅中醫藥大學,甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室,甘肅 蘭州 730000;2.敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室,甘肅 蘭州 730000)

胃癌是發病率、死亡率分別位居第5、3 位的惡性腫瘤,目前臨床治療以手術結合化療為主,但效果有限,晚期患者采用一線化療方案的無進展生存率不到1 年,平均總生存時間不到2 年[1-2]。大量研究顯示,中醫藥在抗腫瘤聯合治療中起到了減毒增效的良好療效[3-4]。敦煌醫學具有重要的史料和臨床價值,敦煌平胃丸出自敦煌古書《不知名氏辨脈法》,甘肅省名中醫王道坤教授將此方進行加減研發的萎胃靈膠囊在治療慢性萎縮性胃炎、防癌變方面取得顯著臨床效果[5-6],故本實驗觀察該制劑對人胃癌SCG-7901 裸鼠移植瘤的抑制作用,并初步探討其機制。

1 材料

1.1 細胞和動物 人胃癌細胞株SCG-7901 (北京北納創聯生物技術研究院)。BALB/c 裸鼠60 只,SPF 級,雌雄各半,周齡4 周左右,平均體質量18～20 g,購于甘肅中醫藥大學動物實驗中心,動物生產許可證號SCXK (甘) 2015-0002)。本研究經甘肅中醫藥大學動物倫理委員會審查批準(編號2019-200)。

1.2 藥物 敦煌平胃丸免煎顆粒(甘肅省中醫藥大學附屬醫院,批號8112053) 由大黃15 g、苦參15 g、干姜15 g、藁本15 g、附子12 g、防風15 g、桔梗15 g、土鱉蟲15 g、人參15 g、玄參15 g、當歸15 g 組成。順鉑(合肥巴斯夫生物科技有限公司,批號BSF190225,50 mg/支),以0.9%生理鹽水配制備用。

1.3 試劑與儀器 RPMI-1640 培養液(美國Gibco 公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；TUNEL凋亡檢測試劑盒(美國BD 公司)；細胞懸液制備試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司,批號2019425)；caspase 9、Bcl-2、caspase 3 抗體 (美國GeneTex 公司)。IX-81 型熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus 公司)。

2 方法

2.1 細胞培養及模型建立 SCG-7901 在含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養基中常規培養,將處于對數生長期的該細胞重懸,并調整濃度為1×107/mL,于52 只裸鼠腋下接種0.2 mL 懸浮液,剩余8 只在相同條件下飼養,但不進行任何干預。1 周后,選取瘤體直徑大于5 mm、形態較均一的32 只裸鼠作為荷瘤成功,進行下一步實驗。

2.2 敦煌平胃丸的制備 將敦煌平胃丸免煎顆粒溶于75 mL煮沸的蒸餾水中,相當于生藥量0.7 g/mL,-20 ℃下貯存。

2.3 分組與給藥 以未荷瘤的8 只裸鼠為對照組(管飼法喂以10 mL/kg 0.9%NaCl 溶液)。根據給藥方式,將32只荷瘤裸鼠隨機分為模型組(管飼法喂以10 mL/kg 0.9%NaCl 溶液)、平胃丸組(管飼法喂以140 mg/kg 平胃丸)、順鉑組(腹腔注射20 mg/kg 順鉑)、平胃丸+順鉑組(管飼法喂以140 mg/kg 平胃丸+腹腔注射20 mg/kg 順鉑),于荷瘤成功后24 h 內給藥,每天1 次,連續10 d。

2.4 臟器指數、抑瘤率計算 裸鼠給藥后,每隔1 d 測量腫瘤短徑、長徑各1 次,根據Steel 公式[(長徑×短徑2)/2]計算其體積。停止給藥后24 h,脫頸處死裸鼠并解剖,觀察腫瘤生長狀況、周圍臟器受累情況,小心并快速剝離腫瘤組織及主要臟器,濾紙吸干組織液后稱定質量,置于-80 ℃冰箱中保存,或用4%多聚甲醛溶液固定48 h。抑制率=(1-V實驗組/V對照組) ×100%,臟器指數=臟器平均質量/裸鼠平均體質量。

2.5 病理組織學觀察及免疫組化分析 將所需組織用4%多聚甲醛固定48 h 后,常規石蠟包埋切片,HE 染色,光學顯微鏡下觀察其病理情況。將低聚甲醛固定的腫瘤組織切片(厚4 μm) 固定在載玻片上,進行免疫組化染色,按照試劑盒說明書操作加入按比例稀釋的一抗caspase 9(1∶200)、Bcl-2 (1∶100)、Bax (1∶200),以PBS 代替一抗作為陰性對照,二抗用辣根過氧化物酶標記,DAB 顯色。通過Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件對結果進行判定,每張切片在400 倍下隨機選取5 個視野,對視野內棕黃色陽性信號進行圖像分析,測定平均積分吸光度值(OD)。

2.6 腫瘤組織中細胞凋亡情況檢測 采用TUNEL 法。將上述石蠟包埋的腫瘤組織以4 μm 厚度切片,按照TUNEL檢測試劑盒說明書操作檢測組織中細胞凋亡情況。每張切片在高倍鏡(×400) 下隨機選取5 個視野,計數細胞總數及凋亡細胞數量,計算凋亡率,公式為凋亡率=(凋亡細胞數/腫瘤細胞總數) ×100%。

2.7 統計學分析 通過SPSS 21.0、Graph Pad Prism 8.0軟件進行處理,計量資料以() 表示,多組間比較用單因素方差分析。 P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 裸鼠一般情況、體質量 荷瘤成功后,各組裸鼠飲食、行為、精神狀態等均正常,用藥初期亦然。與對照組比較,模型組裸鼠一般情況基本正常；給藥后期,順鉑組裸鼠飲食和行動減少,精神狀態和毛發光澤較差,出現抱團現象,體質量降低(P＜0.01)；平胃丸組裸鼠一般情況基本正常；平胃丸+順鉑組裸鼠飲食、行動略有減少,體質量下降,但與順鉑組比較有所改善(P＜0.01)。各組裸鼠體質量見圖1。

3.2 裸鼠移植瘤體積 與對照組比較,平胃丸組、順鉑組、平胃丸+順鉑組裸鼠移植瘤體積減小(P＜0.01),抑瘤率分別為45.1%、67.2%、70.0%。見圖2。

3.3 裸鼠移植瘤病理形態學 模型組裸鼠瘤細胞排列密集紊亂,多見病理性核分裂現象,瘤體較大,壞死較多；敦煌平胃丸組裸鼠瘤細胞排列紊亂,病理性核分裂象略少,可見多個核固縮,壞死較少；順鉑組裸鼠瘤細胞排列紊亂,見多個核固縮,偶有病理性核分裂象,瘤體較小,壞死少；平胃丸+順鉑組裸鼠瘤細胞排列紊亂,見多個核固縮和核碎裂,偶有病理性核分裂象,瘤體小,基本無壞死。見圖3。

3.4 裸鼠移植瘤凋亡 與模型組比較,各給藥組凋亡率均升高(P＜0.01),以平胃丸+順鉑組更明顯(P＜0.01)。見圖4、表1。

3.5 裸鼠移植瘤凋亡相關蛋白 與模型組比較,各給藥組caspase 9、caspase3 表達升高(P＜0.01)；與順鉑組比較,平胃丸+順鉑組caspase 9、caspase3 表達升高(P＜0.05)；與模型組比較,順鉑組、平胃丸+順鉑組Bcl-2 表達降低(P＜0.01),而平胃丸組無明顯變化(P＞0.05)。見圖5、表2。

圖2 各組裸鼠移植瘤體積

圖3 各組裸鼠移植瘤形態學（×400）

圖4 各組裸鼠移植瘤細胞凋亡（×400）

表1 平胃丸聯合順鉑對裸鼠移植瘤凋亡率的影響（，n=8）

表1 平胃丸聯合順鉑對裸鼠移植瘤凋亡率的影響（，n=8）

注:與模型組比較,**P＜0.01；與順鉑組比較,△△P＜0.01。

3.6 裸鼠脾臟形態學 荷瘤不會引起裸鼠脾指數及形態學的改變。與模型組比較,順鉑組裸鼠脾指數升高 (P ＜0.01),并破壞脾臟形態結構,HE 染色鏡下可見紅髓、白髓結構不清,淋巴小結結構破壞,出現多個巨核細胞；與順鉑組比較,平胃丸+順鉑組裸鼠脾腫大改善(P＜0.05),部分恢復了脾臟形態結構,可見紅髓、白髓結構,淋巴小結數量增多,而平胃丸組不影響脾臟大小和形態結構。見圖6、表3。

4 討論

胃癌屬于中醫“噎膈” “癥瘕” “積聚” “伏梁” “心腹痞” “胃脘痛” 范疇,其發生是一個邪氣漸深、正氣漸傷的過程,從正常的胃上皮,經歷炎癥、萎縮、腸化生、異型增生,進而發展為胃癌,從起初傷經傷氣,到后期傷絡傷血,最終導致脾虛陽陷、凝痰聚瘀、胃失和降。敦煌平胃丸中君藥大黃破癥瘕積聚,留飲宿食,蕩滌腸胃；臣藥附子、干姜溫陽散寒；苦參清熱燥濕；藁本、防風、桔梗合用既可升發脾之清陽之氣,又可宣利肺氣,布散津液,杜絕水濕形成；土鱉蟲活血破瘀,通絡止痛；人參益氣健脾；玄參養陰；當歸養血,全方配伍嚴謹,寒熱并用,虛實兼顧,氣血同調,可治脾胃陽虛、脾不運化引起的寒熱錯雜、氣滯血瘀和升降失調,臨床上治療慢性萎縮性胃炎及胃脘痛療效顯著[5,7],但鮮有該制劑治療胃癌的報道。本實驗發現,敦煌平胃丸單用對胃癌移植瘤的抑制作用明顯,抑瘤率達45.1%,有望進一步從中開發相關小分子藥物。

表2 平胃丸聯合順鉑對裸鼠移植瘤凋亡相關蛋白的影響（，n=8）

表2 平胃丸聯合順鉑對裸鼠移植瘤凋亡相關蛋白的影響（，n=8）

注:與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與順鉑組比較,ΔP＜0.05,ΔΔ P＜0.01。

圖5 各組裸鼠移植瘤凋亡相關蛋白（×400）

圖6 各組裸鼠脾臟形態學（×400）

表3 平胃丸聯合順鉑對裸鼠脾指數的影響（，n=8）

表3 平胃丸聯合順鉑對裸鼠脾指數的影響（，n=8）

注:與對照組比較,**P＜0.01；與模型組比較,ΔΔ P＜0.01；與順鉑組比較,#P＜0.05。

腫瘤細胞中凋亡減弱、誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的主要方式之一,本實驗發現敦煌平胃丸干預后胃癌移植瘤凋亡率顯著增加,與順鉑聯用后凋亡率顯著升高,表明該制劑抗胃癌機制之一是促進胃癌細胞凋亡；促凋亡蛋白caspase 9、caspase 3 表達顯著上調,抗凋亡蛋白Bcl-2 表達顯著下調；聯用順鉑后,促凋亡蛋白caspase 9、caspase 3表達顯著升高。凋亡涉及死亡受體介導(外源) 途徑和線粒體(固有) 途徑,各種內部刺激(如DNA 損傷、缺氧、氧化應激等) 可激活后者,導致線粒體外膜完整性喪失和細胞色素C 釋放,與Apaf-1、caspase-9 一起形成凋亡小體復合物,最終導致效應胱天蛋白caspase 3 被激活,誘發細胞凋亡,并受Bcl-2 家族蛋白的調控[8],可知caspase-9 是固有凋亡途徑中的啟動子caspase,推測敦煌平胃丸可能通過復雜的機制激活胃癌細胞內caspase-9 依賴的固有凋亡途徑,最終激活其促進細胞凋亡。大量研究報道,caspase-9介導的天然化合物引起細胞凋亡,包括異硫氰酸酯、大黃素、丹參酮ⅡA、熊果酸等[9-10],而敦煌平胃丸中君藥大黃的主要藥效成分大黃素可通過多種機制促進腫瘤細胞凋亡,包括靶向caspase 9[11-12],故可從化合物角度進一步探討該制劑促進腫瘤凋亡的機制。

化療藥物會引起很多不良反應,如胃腸毒性、骨髓抑制、脾損傷等,從而影響療效,甚至危及患者生命。近年來研究顯示,中草藥聯合放化療在腫瘤治療中發揮了很好的減毒增效作用[13]；本實驗發現,敦煌平胃丸聯合順鉑可減輕后者單用造成的脾毒性,表現在減輕化療造成的脾腫大,恢復脾形態結構,增加淋巴小結數量以增強機體免疫力。脾臟是重要的免疫器官和髓外造血器官,化療期間患者會出現免疫力低下、血細胞減少等臨床表現,而敦煌平胃丸可以緩解順鉑對胃癌荷瘤裸鼠造成的脾損傷,與該制劑用藥組方的治法治則符合。

綜上所述,敦煌平胃丸可通過激活固有凋亡途徑來抑制胃癌移植瘤的生長,與順鉑聯用后可增加凋亡,并減緩順鉑造成的脾損傷,但其發揮療效的物質基礎和具體分子機制還有待進一步探討。今后,可通過網絡藥理學、分子對接等技術來尋找可能的小分子物質并進行配伍,并采用分子生物學實驗探討其療效及機制,以期為尋找療效顯著、毒性較低的治療胃癌小分子藥物提供方向。