蘇合香揮發油對腦缺血再灌注誘導神經細胞損傷的影響

陳 雨 林高城白 亮

(1.福建中醫藥大學附屬康復醫院神經康復二科,福建 福州 350003;2.福建省康復技術重點實驗室,福建福州 350031)

中風是由腦血管破裂或血管阻塞引起的一種腦損傷,每年在世界上內可造成4 400 萬人殘疾[1]。其中,缺血性中風會導致認知功能障礙和神經功能缺損[2],目前有效減少梗塞面積的溶栓術是其主要治療方法[3],但在恢復血液灌注后,缺血性腦組織中經常會發生不可逆的腦缺血再灌注損傷,嚴重限制了缺血性中風患者的康復。

蘇合香是金縷梅科植物蘇合香樹Liquidimibar orientalis Mill.的樹干滲出的香樹脂經加工精制而成的中藥,具有開竅、辟穢、止痛的功效,用于治療中風痰厥、猝然昏倒、胸痹心痛、胸腹冷痛、驚癇[4],揮發油是其重要藥效成分之一,對頸動脈結扎的不完全性腦缺血再灌注損傷大鼠具有一定保護作用,夠減輕氧化應激損傷和抑制腦細胞凋亡[5],但該藥材在糖氧剝奪/再復氧誘導的腦缺血再灌注損傷中的作用及其機制尚不清楚。Toll 樣受體9 (TLR9)是TLR 家族成員之一,已被證實在腦梗死大鼠中的表達明顯上調,參與腦梗死后的組織修復和炎癥損傷過程[6]。本實驗以體外培養的大鼠皮層神經細胞為對象,利用糖氧剝奪/再復氧建立腦缺血再灌注損傷模型,以研究蘇合香揮發油對其神經細胞增殖、凋亡、氧化應激的影響,通過TLR9探索其潛在分子機制,為相關治療劑提供參考。

1 材料

SD 大鼠[出生1～2 d,動物生產許可證號SCXK (滬)2014-0003]購自上海斯萊克實驗動物有限公司。蘇合香購自亳州清逸中藥材有限公司。神經元培養基(Neurobasal-A medium) 購自美國Gibco 公司；兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (caspase-3)、兔抗TLR9、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 一抗購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA) 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 蘇合香揮發油制備 參照文獻[7]報道,水蒸氣蒸餾法提取50 g 藥材的揮發油,無水硫酸鈉干燥后,得到淺黃色透明油狀物(收油率為0.25%)。

2.2 細胞培養與處理 大鼠皮層神經細胞的分離培養參照王凱華[8]報道的方法進行。細胞貼壁后在神經元培養基中培養,生長環境為37 ℃、5% CO2,將培養6～7 d 的神經細胞分為正常對照組、模型組(神經細胞通過OGD/R 模擬腦缺血再灌注損傷) 及10、20、40 μg/mL 蘇合香揮發油組(揮發油和腦缺血再灌注處理神經細胞)[9]。其中,腦缺血再灌注損傷根據周轉利[10]的報道,采用物理缺氧方法,以無糖神經元培養基代替原有培養基,將細胞于含1%O2、94%N2、5%CO2的三氣培養箱中進行OGD 處理1 h,之后更換為正常神經元培養液再復氧24 h。蘇合香揮發油作用時間為24 h。

2.3 細胞轉染與處理 si-TLR9、si-TLR9 的陰性對照si-NC、pcDNA3.1-TLR9,以及pcDNA3.1-TLR9 的陰性對照pcDNA3.1 均由上海GenePharma 公司合成。將神經細胞(2×104個) 接種于6 孔板,當其融合至70% 時根據Lipofectamine 2000 試劑說明書指示,通過si-TLR9、pcDNA3.1-TLR9 進行轉染,轉染后的細胞分為si-NC 組、si-TLR9 組、40 μg/mL 蘇合香揮發油+pcDNA3.1 組、40 μg/mL 蘇合香揮發油+pcDNA3.1-TLR9 組,均進行腦缺血再灌注處理。轉染24 h 后收集細胞,評價其腦缺血再灌注損傷的影響。

2.4 細胞存活檢測 采用CCK-8 法。將神經細胞(5×104/孔) 接種到96 孔板上,經“2.3” 項下方法處理后加入20 μL CCK-8 溶液,于37 ℃、5% CO2環境中孵育,1 h后通過酶標儀在450 nm 波長處讀取每孔吸光度。

2.5 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術。收集神經細胞(1×106個),195 μL 含FITC-annexin V 的結合緩沖液重懸,加入5 μL Annexin V-FITC,混勻,10 μL PI 染色液混勻,于黑暗、室溫下孵育,30 min 后置于流式細胞儀上檢測細胞凋亡。

2.6 caspase-3、TLR9 蛋白表達檢測 采用Western blot法。RIPA 裂解緩沖液裂解各組神經細胞后,等量(20 μg)蛋白加到上樣緩沖液中后沸水變性10 min,在8%～12%十二烷基硫酸鈉(SDS) -聚丙烯酰胺凝膠(PAGE) 電泳凝膠上分離,電轉移到聚偏二氟乙烯膜,5%脫脂牛奶封閉印跡并過夜,將聚偏二氟乙烯膜與一抗孵育2 h,與二抗孵育1 h,其中caspase-3、TLR9 蛋白一抗以1∶1 000 比例稀釋,對照GAPDH 以1∶2 000 比例稀釋,二抗以1∶5 000 比例稀釋。孵育結束后,通過增強型化學發光液對結合抗體進行可視化,Quantity One 軟件分析caspase-3、TLR9 蛋白條帶。

2.7 SOD 活性、MDA 水平檢測 采用試劑盒法。收集各組神經細胞,按照檢測試劑盒說明書操作檢測SOD 活性、MDA 水平。

2.8 TLR9 mRNA 表達檢測 采用qPCR 法。收集各組神經細胞,磷酸鹽緩沖液洗滌后加入TRIzol 試劑分離細胞總RNA,cDNA 的合成通過Prime Script RT 試劑盒進行,再根據制造商說明,通過SYBR Green Master Mix 試劑盒在ABI 7500 PCR 儀進行qPCR 反應。TLR9 引物序列為正向5′-CCAGTTTGTCAGAGGGAGCC-3′,反向 5′-GGACAGGTGGACGAAGTCAG-3′；內參GAPDH 引物序列為正向5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,反 向 5′-CACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′,通過2-ΔΔCt法計算TLR9 mRNA 表達。

2.9 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理,數據以() 表示,組間比較采用單因素方差分析、t 檢驗、SNK-q 檢驗,P＜0.05 表示差異具有有統計學意義。

3 結果

3.1 蘇合香揮發油對腦缺血再灌注損傷的影響 圖1、表1 顯示,與正常對照組比較,模型組神經細胞存活率降低(P＜0.05),凋亡率、caspase-3 蛋白表達升高(P＜0.05)；與模型組比較,各劑量蘇合香揮發油組神經細胞存活率升高(P ＜0.05),凋亡率、caspase-3 蛋白表達降低 (P ＜0.05),并呈濃度依賴性。

圖1 蘇合香揮發油對腦缺血再灌注損傷模型凋亡（A） 及caspase-3 蛋白表達（B） 的影響

表1 蘇合香揮發油對腦缺血再灌注損傷的影響（，n=9）

表1 蘇合香揮發油對腦缺血再灌注損傷的影響（，n=9）

注:與正常對照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。

3.2 蘇合香揮發油對SOD 活性、MDA 水平的影響 表2顯示,與正常對照組比較,模型組SOD 活性降低(P ＜0.05),MDA 水平升高(P＜0.05)；與模型組比較,各劑量蘇合香揮發油組SOD 活性升高(P＜0.05),MDA 水平降低(P＜0.05),并呈濃度依賴性。

3.3 蘇合香揮發油對TLR9 表達的影響 圖2、表3 顯示,與正常對照組比較,模型組TLR9 mRNA 及蛋白表達升高(P＜0.05)；與模型組比較,各劑量蘇合香揮發油組TLR9mRNA 及TLR9 蛋白表達降低 (P ＜0.05),并呈濃度依賴性。

表2 蘇合香揮發油對SOD 活性、MDA 水平的影響（，n=9）

表2 蘇合香揮發油對SOD 活性、MDA 水平的影響（，n=9）

注:與正常對照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。

圖2 各組TLR9 蛋白表達

表3 蘇合香揮發油對TLR9 表達的影響（，n=9）

表3 蘇合香揮發油對TLR9 表達的影響（，n=9）

注:與正常對照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。

3.4 抑制TLR9 對腦缺血再灌注損傷及SOD 活性、MDA 水平的影響 圖3、表4 顯示,與si-NC 組比較,si-TLR9 組TLR9 和caspase-3 蛋白表達、凋亡率、MDA 水平降低(P＜0.05),存活率、SOD 活性升高(P＜0.05)。

3.5 過表達TLR9 對腦缺血再灌注損傷的影響 圖4、表5顯示,與40 μg/mL 蘇合香揮發油+pcDNA3.1 組比較,40 μg/mL 蘇合香 揮發油+pcDNA3.1-TLR9 組 TLR9 和caspase-3 蛋白表達、凋亡率升高(P＜0.05),細胞存活率降低(P＜0.05)。

3.6 過表達TLR9 對SOD 活性、MDA 水平的影響 表6 顯示,與40 μg/mL 蘇合香揮發油+pcDNA3.1 組比較,40 μg/mL 蘇合香揮發油+pcDNA3.1-TLR9 組SOD 活性降低(P＜0.05),MDA 水平升高(P＜0.05)。

圖3 抑制TLR9 對TLR9 （A）、caspase-3 （B） 蛋白表達的影響

表4 抑制TLR9 對腦缺血再灌注損傷及SOD 活性、MDA 水平的影響（，n=9）

表4 抑制TLR9 對腦缺血再灌注損傷及SOD 活性、MDA 水平的影響（，n=9）

注:與si-NC 組比較,*P＜0.05。

圖4 過表達TLR9 對TLR9 （A）、caspase-3 （B） 蛋白表達的影響

4 討論

目前,對缺血性中風的治療方法主要包括手術和藥物,其中神經保護劑是特異性治療的主要方法[11],但腦缺血再灌注損傷機制復雜,涉及多種信號途徑和生物學過程[12]。本實驗探討了蘇合香揮發油在改善腦缺血再灌注損傷中的生物學功能,并初步研究了其潛在的分子機制,發現該成分可通過減輕氧化應激損傷來發揮神經保護作用,可能通過下調TLR9 表達來有效抑制氧化應激,表明蘇合香有望成為相關新型天然藥物。

表5 過表達TLR9 對腦缺血再灌注損傷的影響（，n=9）

表5 過表達TLR9 對腦缺血再灌注損傷的影響（，n=9）

注:與40 μg/mL 蘇合香揮發油+pcDNA3.1 組比較,*P＜0.05。

表6 過表達TLR9 對SOD 活性、MDA 水平的影響（，n=9）

注:與40 μg/mL 蘇合香揮發油+pcDNA3.1 組比較,*P＜0.05。

蘇合香具有多種生物活性,如醒腦開竅、抗心肌缺血抗血栓、抗血小板凝聚等[13],其揮發油含安息香酸、苯甲醇、α-松油醇等成分[7]。前期報道,在頸動脈結扎誘導的腦缺血再灌注損傷大鼠中,蘇合香揮發油可引起腦組織較低的MDA 水平、細胞凋亡率,以及較高的SOD 活性,通過減輕氧化應激損傷來起到保護效果[14]；提高二亞硫酸鈉導致PC12 細胞活性,保護缺血缺氧PC12 細胞損傷[9]；本實驗發現,該成分可明顯提高腦缺血再灌注損傷的神經細胞存活率,顯著降低凋亡率、caspase-3 蛋白表達,并呈現濃度依賴性。

腦組織易受自由基破壞,氧化應激在腦缺血再灌注損傷的發病機理中起著重要作用[15]。研究表明,缺氧/氧自由基會介導過度的ROS 生成和氧化應激,導致神經和膠質細胞死亡[16-17],神經組織由于耗氧量、多不飽和脂肪酸含有量高,抗氧化能力相對較低,導致容易受到氧化攻擊[17],而蘇合香揮發油可通過抑制氧化應激來發揮顯著的神經保護作用。在蘇合香揮發油處理后的腦缺血再灌注損傷模型中,抗氧化酶SOD 活性明顯升高,脂質過氧化中產物MDA 水平顯著減少,并呈濃度依賴性,表現了較強的抗氧化能力,與前期報道[14]相符。另外,在發生腦缺血再灌注損傷時,蘇合香揮發油減輕氧化應激是神經細胞促增殖和抗凋亡的原因,有助于神經功能的恢復。

不同質量濃度蘇合香揮發油可顯著降低腦缺血再灌注損傷神經細胞中TLR9 mRNA、TLR9 蛋白表達,并呈濃度依賴性,可能與調控TLR9 表達有關。TLR9 在腦梗死早期大鼠的炎癥過程中發揮了重要作用[18]；在缺血性急性腎損傷中它促進細胞損傷和凋亡,加劇缺血性急性腎損傷[19]；在非酒精性脂肪性肝炎中其表達上調,缺失時對肝細胞損傷具有一定的保護作用[20]；本實驗發現,抑制TLR9 時可明顯增加腦缺血再灌注損傷的神經細胞存活率和SOD 活性,顯著減少凋亡率、caspase-3 蛋白表達、MDA 水平,表明抑制TLR9 可通過提高腦缺血再灌注損傷細胞增殖,減輕氧化應激、抑制細胞凋亡來產生保護效果。另外,過表達TLR9 能減弱蘇合香揮發油對腦缺血再灌注損傷神經細胞存活、SOD 活性的促進作用,以及對細胞凋亡率、caspase-3 蛋白表達、MDA 水平的抑制作用,表明該成分可能是通過抑制TLR9 表達來實現對腦缺血再灌注損傷的保護作用。

綜上所述,蘇合香揮發油可促進腦缺血再灌注損傷神經細胞增殖,抑制細胞凋亡,減輕氧化應激,表現出神經保護活性,其作用機制可能與下調TLR9 表達有關,可為該藥材在相關治療方面的潛力提供了新證據。