牡丹根腐病拮抗菌的分離與鑒定*

孟國慶，張順響，黃一鳴，王宜磊

(菏澤學院農業與生物工程學院, 山東 菏澤 274015)

引言

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndrews)，芍藥科植物，有3 000年的種植歷史.牡丹不僅作為一種觀賞性花卉，同時也是珍貴的中草藥材，深受人們喜愛.而山東菏澤是牡丹的主要產出地之一，2019年牡丹種植總規模達到49萬畝，被譽為世界上最大的牡丹生產基地[1].另外，由于牡丹籽的高含油量，油用牡丹在菏澤地區被作為木本油料植物[2]種植，種植規模達到了15萬余畝.

牡丹作為多年生落葉灌木植物， 根部病害會因為土壤中病原微生物的積累而越來越嚴重.其中，由茄病鐮孢菌(Fusariumsolani)引起的根腐病就是牡丹根部病害的一種，根腐病會造成牡丹植株矮小，葉片發黃，地下根系發黑腐爛，引起牡丹植株的枯萎死亡.每年因根腐病害給牡丹種植業造成巨大經濟損失，種植年限的增加是引起牡丹根腐病發病率增高的重要原因之一[3].

目前，對牡丹根腐病防治的主要方法為農藥噴抹，但防治效果不佳，而且殘留的農藥會對自然界的生態平衡造成嚴重的破壞.在環保和安全成為時代主題的今天，綠色無污染的生物防治方法成為防治各種植物病蟲害的首要選擇.

據報道，對煙草疫霉[4]、大豆炭腐病[5]等植株病害的生物防治，是從植株病害附近進行病原菌的拮抗菌和根際促生菌[6]的篩選分離后，研發專用菌劑或菌肥，且取得了較好的實用效果.目前應用于植物根腐病的生物防治菌株主要包括三大類：細菌、真菌和放線菌.在關于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[7]的報道中，研究者發現了解淀粉芽孢桿菌對苦瓜枯萎病(Cucurbitwilt)和稻瘟病(Magnaportheoryzae)等一些植物的真菌病害有不錯的防治效果.解淀粉芽孢桿菌可以通過分泌幾丁質酶和伊枯草菌素等物質拮抗病原真菌類.此外，有研究報道木霉(Trichodermasp.)[8]對多種植物真菌病害具有較好的生物防治效果，主要是通過競爭與抗生作用、誘導植物增強抗性作用等生防機制，對鐮刀菌 (Fusarium-spp.) 、腐霉菌 (Pythiumspp.)等植物病害真菌產生抑制效果.這證明從植株病原菌所處自然環境中篩選拮抗菌的方法有效可行.

本實驗通過平板對歭法篩選牡丹根際土壤中穩定、高效拮抗牡丹根腐病原菌的微生物，為生物防治牡丹土傳病害菌肥的開發與應用拓展微生物資源.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤

菏澤學院植物園、曹州牡丹園多年生牡丹發病植株根際土壤.

1.1.2 供試根腐病原菌

茄腐鐮孢菌(Fusariumsolani)為菏澤學院農業與生物工程學院微生物實驗室保藏并提供的.

1.1.3 實驗培養基

PDA培養基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，補至1 000 mL，pH自然，于112 ℃濕熱滅菌20 min.

LB培養基：NaCl 5.0 g，酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂20.0 g，補至1 000 mL ，20% 氫氧化鈉調pH 至7.2，于121 ℃濕熱滅菌20 min.

淀粉培養基[9]：淀粉水解生化實驗.

葡萄糖蛋白胨水培養液和糖發酵培養基[9]：生化實驗.

1.2 實驗方法

1.2.1 采集土壤

在菏澤學院植物園、曹州牡丹園多年生發病牡丹植株根際附近采集土樣.撥開土層約6 cm采集發病植株根際土樣，每個采樣點取樣后，標記備用.

1.2.2 土壤稀釋及涂布培養

將取回的土樣烘干過篩，稱取10 g，混勻在已滅菌且裝有90 mL蒸餾水的錐形瓶中，充分搖勻30 min，然后在進行梯度稀釋.涂布LB培養基平板，于30 ℃恒溫箱培養，采用三區劃線法對菌落分離純化.

1.2.3 拮抗菌篩選

對分離出的菌落，采用平板對歭[10]法篩選牡丹根腐病茄病鐮孢菌的拮抗菌.

初篩：以茄病鐮孢菌作為靶標菌，點種于PDA平板中心，將分離純化的菌落用牙簽分三點接種于距靶標菌周圍25 mm位置，28 ℃恒溫箱培養2～4 d后觀察.點種菌落與靶標菌菌落之間存在抑制帶現象或抑制圈，即判定該分離的菌株與牡丹根腐病菌存在生長發育或繁殖等方面的拮抗效應.記錄拮抗初篩結果，開展復篩工作.

復篩：重復平板對峙試驗，將有拮抗效應的菌落再次點種于PDA培養基中央靶標菌菌落25 mm處，對稱兩點接種初篩得到的菌株.恒溫箱中28 ℃培養，2～4 d，驗證和測量其拮抗效果，并進一步做好優良拮抗菌株的篩選和優化.

1.3 形態學和生理生化特征的觀察

在完成對拮抗菌的初篩和復篩工作，在超凈工作臺的環境中完成在LB培養基上劃線.30 ℃的恒溫箱中培養72 h，對菌落的大小與形態，透明度與顏色等特征記錄.分別參閱《常見細菌鑒定手冊》[11]和《真菌鑒定手冊》[12]對分離到的細菌和真菌進行初步鑒定.

1.4 生理生化實驗

參考《微生物學實驗手冊》[9]，對所篩選的拮抗細菌菌株R9和菌株R15進行革蘭氏染色，芽孢染色及生理生化實驗.所有理化實驗均設置對照組.

1.5 分子生物學實驗

1.5.1 拮抗細菌16S rDNA的PCR擴增和測序

PCR擴增過程： 95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s, 72 ℃ 延伸2 min，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min.實驗所用的引物為：P1(5′-AACTGAAGTTTGATCATTCA-3′)和 P2(5′-TACGGTTACCTTGTTACATGCC-3′)擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由南京擎科生物科技有限公司完成測序.

1.5.2 序列測定結果分析

將獲得的16S rDNA序列與NCBI數據庫序列進行Blast比對分析，并通過軟件MEGA 5.1中的Neighbor-Joining法[13]完成系統發育樹的構建.

2 結果與分析

2.1 拮抗菌篩選

根據菏澤學院植物園、曹州牡丹園多年生牡丹發病植株根際采集的土樣.分離純化后得32株不同菌落特征的微生物.以實驗室現有牡丹根腐病菌茄病鐮孢菌為靶標菌，采用平板對歭法，初篩共得到3株對茄病鐮孢菌具有拮抗作用的微生物 (見圖1)，分別為命名為菌株R1、R9、R15.

圖1 菌株的對歭初篩

進一步對初篩獲得的3株具有良好拮抗性能的菌株進行復篩，并測量抑菌圈直徑，復篩結果見表1.

表1 抑菌圈直徑大小測量

2.2 拮抗菌的鑒定

2.2.1 形態學鑒定

將分離到的3株菌株分別點接或三區劃線接種到固體培養基進行培養，并觀察其菌落形態.菌株R1、R9與R15菌落形態及電鏡照片見圖2，形態描述見表2.

圖2 3株菌的菌落形態觀察

表2 3株菌的菌落形態特征

2.2.2 生理生化鑒定

根據菌落特征和《常見細菌鑒定手冊》[11]，菌株R9和R15鑒定為細菌，并對菌株R9和R15進行生理生化實驗分析，實驗結果見表3.

表3 生理生化鑒定

生理生化分析結果顯示，菌株R9和R15均為革蘭氏陽性菌，有芽孢，葡萄糖產酸試驗均為陽性.菌株R15具有解淀粉能力，VP實驗結果陽性，吲哚實驗陰性，而菌株R9不能水解淀粉，VP實驗結果陰性，吲哚實驗陽性.

2.2.3 菌株R9和R15的分子生物學鑒定

PCR擴增菌株R9和R15 的16S rDNA和測序，并與NCBI數據庫序列進行Blast比對分析.運用MEGA 5.1的Neighbor-Joining算法構建系統發育樹.菌株R9系統進化樹見圖3，菌株R15系統進化樹見圖4.

圖3 菌株R9系統進化樹

圖4 菌株R15系統進化樹

菌株R9的16S rDNA同Bacillussp. BAB 4854和Bacillussp. 6119的相似度分別為99.64%和99.73%，結合菌株R9的菌落特征將其鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.).

R15菌種經16S rDNA序列比對后，同解淀粉芽孢桿菌(BacillusamyloliquefaciensNBRC 15535)和(BacillusamyloliquefaciensMPA 1034)的序列比對度100%.但因為未處于同一分支，所以表明在系統發育進化過程中不同步.和莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)的16S rDNA序列相似度同樣為100%，但菌株R15和貝萊斯芽孢桿菌(BacillusvelezensisstrainFZB42)、(Bacillusvelezensis-strainCBMB205)同屬一系統進化分支，據此系統進化分析，初步鑒定菌株R15為芽孢桿菌屬貝萊斯芽孢桿菌.

根據菌株R1菌落形態和細胞形態，參照《真菌鑒定手冊》初步將其鑒定為木霉屬真菌，后續借助18S rDNA序列對其進行分子生物學鑒定，明確其具體種類.

3 討論

本實驗從菏澤學院植物園和曹州牡丹園多年生牡丹根際取樣，以茄病鐮孢菌為靶標菌，采用平板對峙實驗，進行拮抗菌株篩選.得到對牡丹根腐病菌具有拮抗性能的真菌1株、細菌2株，命名分別為菌株R1、R9和R15.根據形態學特征、生理生化反應和系統樹構建，分別將菌株R9和R15鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.).根據菌株R1菌落形態和細胞形態，初步將其鑒定為木霉屬真菌.

實驗篩選的菌株R15為芽孢桿菌屬的貝萊斯芽孢桿菌，據報道能夠定殖于根際成熟區，產生的非揮發性物質對植株根部生長有促進作用，是植物根際促生菌[14].木霉屬真菌的生防機制是通過與植物建立類似菌根真菌的關系，刺激植物生長，并誘導植物產生拮抗活性物質[15].

利用合理的技術將生物防治菌有效地運用到防治植株的病害, 同時對環境不造成污染，是生物菌肥在植株病害防治方面的優點，而且生物菌肥對人畜無害.目前生物菌肥在蔬菜和部分花卉種植業中得到應用，但在牡丹植株病害防治方面卻少有研究資料.這表明我們不僅應該研究牡丹植株病害生防菌，而且要開發生物菌肥的生產工藝，讓具有生防功能的生物菌肥早日運用到牡丹的栽培種植中.

實驗研究篩選到的3株拮抗菌為牡丹根腐病的生物防治提供了新的微生物資源.下一步擬研發成生物菌肥，應用到牡丹根腐病害的防治，不僅解決牡丹植株病害方面的問題，也要解決牡丹種植區土壤經過連續多年種植造成的土壤板結問題，土壤有害微生物菌落富集和土壤有益菌數量減少的問題.相信隨著生物菌肥技術的發展，牡丹根部病害的問題會得到有效解決.