胃癌預后相關鐵死亡基因篩選及預后預測模型構建

袁漫秋，裴建贏，何鑫，田麗榮，胥敏敏，李燕平

1 蘭州大學，蘭州 730000；2 甘肅省婦幼保健院科研中心；3 蘭州大學第一醫院檢驗科

胃癌的發病率（5.7%）和病死率（8.2%）在消化道腫瘤中僅次于結直腸癌［1］。因此，尋找與胃癌預后相關的分子標志物、評估胃癌患者的預后風險對指導臨床決策、提高患者生存率具有重要意義。鐵死亡是一種新型的細胞程序性死亡方式，在形態、生化和遺傳學上都區別于細胞凋亡、壞死和自噬等細胞死亡。鐵死亡的發生與鐵依賴過氧化脂質的積聚并導致細胞的致命性損傷有關［2］。研究［3］發現，鐵死亡參與調節肝癌、乳腺癌等癌癥的發生發展。鐵死亡在胃癌細胞中能被顯著抑制，促進腫瘤細胞的生長，降低癌細胞對順鉑和紫杉醇等藥物的敏感性。阿帕替尼能通過降低癌細胞谷胱甘肽水平、增加脂質過氧化水平誘導胃癌細胞的鐵死亡，發揮抗腫瘤作用［4］。目前與鐵死亡相關的基因研究已有較多，但鐵死亡相關差異表達基因與胃癌預后的關系目前并不十分清楚［5］。我們采取生物信息學方法篩選與胃癌預后相關的鐵死亡基因并分析其生物學功能，進一步構建胃癌預后預測模型，對胃癌患者的預后風險進行評估。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 數據來源 在可公開獲得的癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中檢索并下載胃癌基因微陣列圖譜及相關患者的臨床資料，將患者臨床資料和基因表達信息合并后刪除缺失值。胃癌基因微陣列圖譜包含胃癌基因的名稱、樣本編號以及基因在不同樣本中的表達量。患者的臨床信息主要包括年齡、性別、TNM 分級、腫瘤分期、生存時間、生存狀態。共計獲得407 例標本，其中胃癌組織375例份、癌旁組織32例份。刪除缺乏隨訪信息的標本，最終獲得胃癌組織311例份、癌旁組織32例份，共包含60個鐵死亡基因的相關信息。

1.2 與胃癌預后相關的鐵死亡基因篩選

1.2.1 胃癌、癌旁組織鐵死亡基因篩選 通過R軟件中的“limma”軟件包在納入胃癌基因微陣列圖譜信息中篩選鐵死亡基因。以對數轉換的差異表達倍數（FC，Fold Change，差異倍數）log2FC 的絕對值|log2FC|＞1和FDR＜0.05為標準，篩選為胃癌、癌旁組織鐵死亡差異表達基因。

1.2.2 與胃癌患者預后相關的鐵死亡基因篩選采用單因素Cox 回歸分析法分析胃癌患者的總體生存率，篩選與胃癌患者預后相關的鐵死亡基因（P＜0.05）。運用R 軟件中的“Venn”軟件包對鐵死亡差異基因和胃癌患者的預后基因進行交集。最后篩選得到胃癌預后相關的鐵死亡基因。

1.2.3 胃癌預后相關鐵死亡基因的生物學功能分析 采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）軟 件（https//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）探索胃癌預后相關鐵死亡基因高表達時的富集通路（NOMP＜0.05、FDR＜0.05），分析胃癌預后相關鐵死亡基因的生物學功能。

1.3 胃癌預后預測模型構建與驗證

1.3.1 胃癌預后預測模型構建 納入“1.2”得到的胃癌預后相關的鐵死亡基因，運用Lasso Cox 回歸分析法，使用“glmnet”軟件包構建胃癌預后相關的鐵死亡基因的預測模型，即：胃癌預后預測模型=eK1X1+K2X2+……KnXn。其中X 代表預后相關的鐵死亡基因的表達量，K 代表系數。Kn是以預后相關的鐵死亡基因Xn的表達量為自變量，以胃癌患者的總體生存率和生存狀態為因變量計算得到的系數。

1.3.2 胃癌預后預測模型準確性驗證 根據預后預測模型計算數據集中隨訪信息完整的胃癌組織311 例份，并根據評分中位數將納入的胃癌患者分為高、低風險組。下一步采用“survival”、“survminer”軟件包對高、低風險組胃癌患者的生存情況進行分析，繪制生存曲線。通過“timeROC”軟件包繪制受試者工作特征曲線（ROC），并評估預后預測模型準確性。采用“Rtsne”、“ggplot2”軟件包對模型基因中納入的鐵死亡相關差異表達基因進行主成分（Principal Component Analysis，PCA）、t分布隨機鄰居嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）分析，通過變量降維驗證預后預測模型預后評分對高、低風險的患者預后的區分程度。采用單因素Cox 回歸分析、多因素Cox 回歸分析法在“survival”軟件包中評估鐵死亡相關差異表達基因的胃癌預后預測模型測算的評分是否是獨立于其它臨床因素的預后因素。采用單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）及“GSVA”軟件包，對不同預后胃癌患者的免疫細胞、免疫通路進行評分，比較不同預后的胃癌患者免疫細胞、免疫通路差異。

2 結果

2.1 與胃癌患者預后相關的鐵死亡基因及其生物學功能 胃癌組織、癌旁組織中有41 個（68.33%，41/60）鐵死亡基因存在差異表達。其中，與癌旁組織比較，胃癌組織中ACSL3、CS、GCLC、HSBP1、

RPL8、GCLM、CARS1、SAT1、EMC2、G6PD、ABCC1、GSS、AIFM2、PHKG2、ALOX5、NFS1、ACACA、IREB2、ACSL4、CD44、GLS2、TP53、SQLE、FADS2、SLC7A11、TFRC、SLC1A5、FANCD2、NOX1 等29 個基因表達升高，CRYAB、AKR1C1、AKR1C2、MT1G、AKR1C3、HSPB1、ACSF2、NFE2L2、PEBP1、FTH1、NCOA4、ACO1等12個基因表達降低。

采用單因素Cox 回歸分析法初步篩選得到胃癌患者預后相關的鐵死亡基因有CHAC1、ZEB1、NFE2L2、KEAP1 及SLC1A5（HR分別為0.819，1.206，0.674，0.625，0.829；95%CI分別為0.676～0.991，1.022～1.424，0.456～0.997，0.432～0.904，0.703～0.997；P均＜0.05）。

通過Venn 圖交集后得到胃癌患者預后相關的鐵死亡基因為NFE2L2、SLC1A5。其中，NFE2L2 主要參與化學刺激檢測、膜電位調節等生物學功能，SLC1A5主要參與金屬離子傳輸、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶活性調節等生物學功能。

2.2 鐵死亡相關差異表達基因的胃癌預后預測模型及其準確性 胃癌預后預測模型=e（-0.315×NFE2L2）＋（-0.161×SLC1A5）。其中，NFE2L2、SLC1A5 為胃癌組織中基因的相對表達量，-0.315、-0.161 分別為NFE2L2、SLC1A5的系數。

胃癌患者的預后評分模型測算出的患者預后評分對稱分布、無離群值，提示該模型穩健。與預后低風險者（157 例）比較，預后高風險者（154 例）的生存率低（P均＜0.05）。第1、2、3 年鐵死亡相關差異表達基因的胃癌預后預測模型預測患者預后的ROC曲線下面積分別為0.561、0.587、0.615。在患者生存狀態和預后評分分布的散點圖中可見，與預后低風險的胃癌患者比較，預后高風險的胃癌患者生存期短。PCA 分析、t-SNE 分析結果顯示，變量降維后預后評分能有效區分胃癌患者預后的高、低風險。

單因素Cox 回歸分析顯示胃癌患者預后的危險因素為年齡、性別、TNM 分級、TNM 分期、預后評分（HR分別為1.802，1.329，1.229，1.828；95%CI分別為1.237～2.624，0.907～1.984，0.845～1.786，1.253～2.667；P均＜0.05）。多因素Cox 回歸分析顯示，胃癌患者預后的影響因素有年齡、TNM 分期、預后評分（HR分別為1.974，1.862，4.151；95%CI分別為1.350～2.885，1.277～2.717，1.822～9.459；P均＜0.05）。

與低風險胃癌患者比較，高風險胃癌患者肥大細胞、輔助T 細胞、B 細胞、TIL、樹突狀細胞（DCs）、中性粒細胞、Tfh 細胞等免疫細胞的評分高（P均＜0.05）。Ⅱ型干擾素反應、T 細胞共刺激等免疫通路的評分高，MHC_class_Ⅰ免疫通路的評分低（P均＜0.05）。

3 討論

目前通過內鏡下切除等治療后早期胃癌的治愈率較高，但中、晚期患者經綜合治療后5年生存率仍較低［6］。胃癌的預后與腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移、遠處轉移及治療手段等密切相關。

鐵死亡是由氧化劑和抗氧化劑之間產生的氧化還原失衡引起的一種新型細胞程序性死亡方式，其通過復雜的基因網絡調控參與了包括胃癌等多種癌癥的進程，在腫瘤細胞的生長、增殖中發揮了重要作用［7］。本研究利用生物信息學方法，最終得到與胃癌預后相關的鐵死亡基因為NFE2L2、SLC1A5。NFE2L2，也被稱為NRF2，是鐵死亡過程中一個主要的轉錄因子，它可以協調鐵死亡過程中大量參與鐵代謝、氧化防御和氧化還原信號的細胞保護基因的活化。在同為消化道腫瘤的肝癌中，NEF2L2 參與鐵死亡抵抗進而對肝癌細胞起到保護作用［4］。然而，也有實驗表明，NFE2L2 激活的血紅素氧化酶-1在鐵死亡介導的過程中既可表顯出保護作用，也可表現出細胞毒作用，因此NEF2L2 對腫瘤的具體行為并未完全確定［8］。本研究發現NFE2L2 表達量與預后情況正相關，可能提示保護作用，基因集富集分析提示NFE2L2 可能與化學刺激檢測、膜電位調節等生物學功能有關。基因集富集分析提示SLC1A5與金屬離子傳輸、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶活性調節等生物學功能有關。SLC1A5編碼的丙氨酸—絲氨酸—半胱氨酸轉運體-2（ASCT2）所介導的L-谷氨酰胺攝取是鐵死亡的氨基酸代謝的重要組成部分，同時也參與多種腫瘤細胞的生長［9］。

本研究利用模型對數據集中所有胃癌患者的預后進行評分，并將患者分為高、低風險者。繪制的生存曲線顯示高風險組相較于低風險的生存率顯著降低，表明該模型是對胃癌患者預后風險的評估具有實用價值。該預后預測模型所得預后評分預測患者預后的敏感度、特異度均較高，且隨時間推移，其預測患者預后的準確性有逐漸增加趨勢。此外，根據預后評分散點圖同樣證實高、低風險組的生存率有顯著差異；在PCA 分析、t-SNE 分析中，高、低風險組患者具有良好的區分，再次證實該預后評分模型的穩定性。最后，在獨立預后分析中，該模型的預后評分成為繼年齡、分期之后胃癌的獨立預后因素。綜上，本研究采用多種方法驗證了該模型的有效性。

最后，本研究探尋了高風險組和低風險組在免疫學功能上的差異。結果顯示肥大細胞、漿細胞樣樹突狀細胞（pDCs）和B 細胞在高風險組中評分更高。高風險組中肥大細胞評分顯著增高可能與肥大細胞在腫瘤微環境中分泌血管生成因子及淋巴管生成因子從而促進胃癌細胞的生長和轉移有關［14］；pDCs 既能通過產生干擾素和白介素等細胞因子間接協調抗腫瘤免疫，又能作為抗原呈遞細胞（APC）直接參與免疫過程［11］，B 細胞可以通過產生抗腫瘤抗體來抑制腫瘤的生長［12］。高風險組中pDCs、B 細胞的評分增高可能與高風險組的抗腫瘤反應更為強烈有關。然而B 細胞中的一些調節B 細胞具有抑制表型，可以抑制抗腫瘤反應，并通過產生抗炎細胞因子和抑制分子的表達來支持腫瘤的生長［13］，高風險組中B細胞的增高也可能與此有關。免疫通路中高風險組的評分在Ⅱ型干擾素反應通路、T 細胞共刺激通路上明顯高于低風險組。其中，Ⅱ型干擾素能促進免疫抑制、逃避Ⅱ型干擾素依賴的腫瘤免疫監視、介導腫瘤的生長與進展［13］。T 細胞共刺激是由抗原呈遞細胞上的共刺激配體與T細胞上的TCR 受體結合而產生，是激活T 細胞的非特異信號［14］。高風險組中腫瘤細胞的生長和轉移可能引起更強烈的抗腫瘤免疫，而抗腫瘤免疫所產生的肥大細胞、pDCs、B細胞、T細胞可能與胃癌的預后不良有關。

同時，本文還存在一定的局限性。首先，本研究是基于TCGA 數據庫構建并驗證，受到了地域、人種、樣本數等方面的限制。其次，預后預測模型缺乏前瞻性實驗驗證。

綜上所述，與胃癌預后相關的鐵死亡基因為FE2L2、SLC1A5，據此建立胃癌預后預測模型為=e（-0.315×NFE2L2）＋（-0.161×SLC1A5）。該模型對胃癌患者預后的預測價值較高。與胃癌預后相關的鐵死亡基因NFE2L2 可能與化學刺激檢測、膜電位調節等生物學功能有關，SLC1A5 可能與金屬離子傳輸、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶活性調節等生物學功能有關。肥大細胞、輔助T 細胞及pDCs 等淋巴細胞，Ⅱ型干擾素反應、T 細胞共刺激免疫通路可能在胃癌的發生發展中發揮重要作用。