高效液相色譜法測定中風回語顆粒中大黃酚的含量

張 君，霍志鵬，史嘉雯，張依倩，王 玉，4，何 毅*

(1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天士力控股集團有限公司研究院 現代中藥開發中心，天津 300410；3.天士力醫藥集團股份有限公司 創新中藥關鍵技術國家重點實驗室，天津 300410；4.天津大學 藥物科學與技術學院，天津 300072)

中風回語顆粒是用于治療缺血性腦中風引起的痰瘀阻絡證的中藥復方制劑，源自國醫大師任繼學教授多年臨床經驗總結而成，該方由石菖蒲、酒大黃、膽南星、冰片、黃連、遠志、川芎、郁金、土鱉蟲九味中藥組成[1]，目前已獲得臨床批件。中醫藥治療缺血性腦中風的原則是活血化瘀、通經活絡[2]。大黃是我國常用中藥之一，具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經等功效[3]。大黃經酒炙后結合型蒽醌含量降低，緩和了生大黃的苦寒之性，使瀉下作用緩和，減輕了腹痛等副作用，又增加了活血化瘀的功效[4]。蒽醌類成分為酒大黃的主要活性成分，現代藥理研究表明，該類成分可以通過抗氧化、抗血栓、減輕腦水腫、抑制神經細胞凋亡、抗炎、改善微循環等作用，有效減輕腦缺血缺氧導致的神經損傷[5-9]。大黃酚為蒽醌類成分之一，具有減少炎癥因子、抑制氧化應激等功能，促進損傷神經細胞的修復，發揮腦神經保護作用[9-10]，有文獻[11-15]報道顯示，大黃酚在酒大黃中含量較高，含量范圍約0.19%～1.85%。大黃酚的含量對中風回語顆粒的質量控制和臨床用藥具有一定的指導意義。中風回語顆粒制備工藝包括醇提和水提兩個工藝，現有質量標準中已有醇提工藝中鹽酸小檗堿作為含量測定的指標項[1]，增加水提工藝中大黃酚含量指標能更好地控制藥品質量。因此，本課題建立了中風回語顆粒中大黃酚的含量測定方法，現報告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260液相色譜儀(安捷倫公司，包括自動進樣器、柱溫箱、二元梯度泵、DAD二極管陣列檢測器)；METTER TOLEDO XS205DU電子分析天平(梅特勒公司)；KQ-500DV型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

中風回語顆粒(由天士力控股集團有限公司研究院實驗室自制，批號：20190301、20190501)；大黃酚對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110796-201621)；甲醇、磷酸為色譜純；Milli-Q超純水(美國Millipore公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱采用Dimonsil C18色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，柱溫為30 ℃，流動相為0.1%磷酸水-甲醇(20∶80)，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長254 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取大黃酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含大黃酚24.82 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取中風回語顆粒，研細，精密稱定約1.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足失重，搖勻，濾過。精密量取續濾液10 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液20 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得[3，16-18]。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取除酒大黃外的其他八味中藥，以處方量按工藝制法制成酒大黃陰性對照樣品，按照“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.3 專屬性試驗

取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件分別進樣、測定，陰性樣品溶液在大黃酚對照品相應位置處未見色譜峰，表明本方法測定中風回語顆粒中大黃酚的含量，專屬性良好，見圖1。

注：A.大黃酚對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.大黃酚峰

2.4 精密度試驗

取對照品溶液按“2.1”項下色譜條件分別進樣6次，每次進樣10 μL，測定峰面積，結果大黃酚RSD為0.28%，表明儀器精密度良好。

2.5 線性范圍

精密稱取大黃酚對照品適量，加甲醇配成濃度為10.05、20.11、40.22、80.45、160.90 μg·mL-1的對照品標準溶液，取上述對照溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積，以對照品質量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，得大黃酚的回歸方程為：Y=53 681.0X+2 802.9，r=1.000 0，表明大黃酚進樣濃度在10.05～160.90 μg·mL-1范圍內與峰面積具有良好的線性關系，見圖2。

圖2 大黃酚的標準曲線

2.6 穩定性試驗

取同一份供試品溶液(批號：20190301)，在0、2、4、8、16和24 h分別按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL，結果大黃酚峰面積RSD為0.37%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.7 重復性試驗

取同一供試品(批號：20190301)按“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL，記錄峰面積。結果大黃酚含量平均值為0.269 8 mg·g-1，RSD為2.21%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收試驗

取已知含量的樣品(批號：20190301)，研細，取6份，每份約0.6 g，精密稱定，分別精密加入大黃酚(6.71 μg·mL-1)對照品溶液25 mL，按“2.2.2”項下方法制備加標溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣10 μL測定，計算回收率。結果得大黃酚平均回收率(n=6)為98.16%，RSD為1.17%，結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果 (n=6)

2.9 樣品測定

分別稱取不同批號的中風回語顆粒，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL，記錄峰面積，以外標法計算含量，結果見表2。

表2 中風回語顆粒中大黃酚的含量測定結果

3 討論

3.1 指標性成分的選擇

本課題嘗試了同時測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5個指標性成分方法的開發，處方中含有九味中藥，基質復雜，試驗過程中發現蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和基質中其他成分不能達到基線分離，大黃素甲醚峰面積較低，積分波動大，大黃酚分離度良好，適合用于含量測定，且大黃酚在酒大黃中含量較高[11-14]，有明確的與中風后恢復相關的抗炎、減輕氧化應激損傷，保護神經的作用[9-10]，測定制劑中大黃酚的含量，對中風回語顆粒的質量控制有較大意義，因此選擇大黃酚進行含量測定。

3.2 檢測波長的選擇

經檢索文獻[16-18]及參考《中國藥典》[3]中大黃相關的含量測定方法，均選擇254 nm作為檢測波長。本課題在該波長下進行了樣品分析，大黃酚峰型好，基線平穩，周圍無雜質峰，故選擇254 nm作為檢測波長。

3.3 提取方式的選擇

本課題比較了甲醇溶解提取和鹽酸水解后萃取兩種提取方式，發現甲醇溶解提取的大黃酚含量為水解后萃取的4.84%，表明大黃酚大部分以結合蒽醌形式存在于顆粒中，水解后萃取方式(甲醇超聲溶解-加酸水解-加熱回流-液液萃取)更適合檢測中風回語顆粒中大黃酚的含量。

3.4 流動相的選擇

本課題對0.1%磷酸水-乙腈(15∶85)、0.1%磷酸水-甲醇(15∶85)、0.1%磷酸水-甲醇(20∶80)流動相系統進行了分析比較，發現使用前兩種流動相系統時，大黃酚出峰時間靠前，周圍基線不平穩，0.1%磷酸水-甲醇(20∶80)為流動相時，色譜峰峰型較好，基線平穩，峰分離度較好，且分析時間適宜，故確定流動相為0.1%磷酸水-甲醇(20∶80)。

4 結論

本課題建立了中風回語顆粒中大黃酚的含量測定方法，方法學驗證結果表明該方法準確度高、專屬性強、重復性好，符合《中國藥典》[19]通則9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則的要求，可用于中風回語顆粒質量的控制和評價。同時，該方法對含有大黃藥材的其他中成藥質量研究具有一定參考意義。