肉桂抑菌活性部位提取工藝優化及HPLC定量研究

翁宗昱，李紫晗，孫 琴，王元清

(中南林業科技大學 生命科學與技術學院，湖南 長沙 410004)

肉桂(CinnamomumcassiaPreesl)原名菌桂、牡桂，系樟科樟屬，是重要的藥用和食用植物，國產肉桂為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPreesl)的干燥樹皮[1]，主要分布于廣西、廣東等地，廣西的產量占全國的50%。肉桂中主要含有揮發油、黃酮、黃烷醇、萜類、木質素、多酚、香豆素、皂苷、多糖等多種類型的化合物[2]。揮發油為肉桂的主要活性部位，其中主要有桂皮醛、桂皮醇、甲氧基桂皮醛、α-蒎烯、α-蓽澄茄油萜等[2-3]，現代藥理研究表明肉桂具有減弱腸胃刺激、強心、改善微循環、抗炎等多種生理活性[4]。現代藥理研究亦表明肉桂揮發油中主要成分為桂皮醛，具有解熱、鎮痛、抗炎、降糖、抗菌、抗腫瘤、抗血小板聚集、抗心肌缺血和抗凝血等多種藥理作用[5-8]。現有研究有對肉桂精油提取方法進行報道[9-10]，但是肉桂采用水蒸氣蒸餾法提取時，通常只對精油進行研究，沒有對蒸餾時的芳香水液進行分析。本研究對肉桂中抗菌活性部位進行均勻設計提取工藝優化及主要成分定量分析，以期為肉桂在食品藥品中的開發應用提供依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器

202-OA型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；SPX-250-GB型恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)；G154DW型立式自動壓力蒸汽滅菌器(致微(廈門)儀器有限公司)；YP1002N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；BIO-KONT型比濁管(康泰生物)；1-Hole Punch打孔機(上海堅明辦公用品有限公司)；TS-111B型搖床(上海捷呈實驗儀器有限公司)；Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.2 試藥

肉桂(批號：15120717，執行標準：《中國藥典》2015版，湖南振興中藥飲片實業有限公司)；牛肉膏(北京奧博星生物技術有限責任公司)；蛋白胨(上海禽類蛋品公司禽蛋二廠)；NaCl(西隴化工股份有限公司)；無菌水(自制)；肉桂酸對照品(南昌貝塔生物科技有限公司)；桂皮醛(南昌貝塔生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 肉桂抑菌活性部位篩選

2.1.1 肉桂提取 將100 g肉桂利用水蒸氣蒸餾法提取出肉桂揮發油并收集蒸餾后的芳香水液，將收集好的芳香水液濃縮后定容至100 mL，制得濃度為1 g/mL的濾液，冷藏備用。

2.1.2 抑菌活性篩選 采用濾紙片法測定抑菌活性。移取7 μL的肉桂精油或肉桂濾液分別滴加至兩片直徑為6 mm 的滅菌濾紙片上，使其充分吸附。另外移取7 μL生理鹽水滴加至另一片直徑6 mm的濾紙片上，作為陰性對照。將上述3片濾紙片均勻放置于含有金黃色葡萄球菌試驗菌種的平板上，置恒溫培養箱(37 ℃)中培養24 h后，觀察有無抑菌圈篩選肉桂抑菌活性部位。

2.2 提取工藝

利用水蒸氣蒸餾法提取出肉桂精油，分別對浸泡時間、加水量以及蒸餾時間進行考察，在單因素試驗的基礎上進行均勻設計，獲取肉桂精油的最佳提取工藝參數。

2.3 精油中主要成分含量測定

2.3.1 對照品溶液配制 精密稱取肉桂酸與桂皮醛對照品適量，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，獲得含21 μg/mL的肉桂酸與222 μg/mL的桂皮醛混合對照品溶液。

2.3.2 肉桂精油樣品制備 各取100 μL肉桂精油加900 μL甲醇于EP管中，混勻，再取50 μL加1 950 μL甲醇置于5 mL EP管中，混勻，過濾，即得肉桂精油的液相色譜樣品。

2.3.3 色譜條件 安捷倫色譜柱C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速0.9 mL/min，λ=254 nm，進樣量：10 μL，乙腈：0.1%磷酸水為流動相，時間(min)：0-15-27-35-38-40，乙腈(%)：28-28-35-85-85-28。

2.3.4 樣品含量測定 取樣品與混合對照品在上述色譜條件下進樣測定，采用外標一點法計算精油中肉桂酸與桂皮醛的含量。

3 結果

3.1 抑菌活性部位篩選

采用濾紙片研究肉桂精油和肉桂水液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性圖，抑菌實驗結果如圖1。由圖1可知，肉桂經水蒸氣蒸餾法獲得的肉桂精油有明顯的抑菌圈，而蒸餾時的芳香水提液沒有抑菌圈，表明肉桂精油對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，而芳香水液無抑菌作用，從而篩選出肉桂抑菌活性部位為精油。

圖1 肉桂精油(A)、肉桂芳香水液(B)對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

3.2 單因素考察結果

選擇影響精油提取率的幾個主要因素：浸泡時間、加水量、提取時間進行單因素試驗，試驗結果見圖2，為均勻設計試驗提供基礎。

浸泡時間的影響：每份100 g剪碎的肉桂均加水600 mL，不同的浸泡時間(0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h)，提取時間均為6 h，考察不同浸泡時間的精油提取量。由圖2可知，浸泡時間為0.5 h時，肉桂精油的提取量最高；隨著浸泡時間的延長，肉桂精油提取量變化不明顯。可能在0.5 h內，溶液已經充分滲透進肉桂粗粉組織中，使組織中達到飽和。

加水量的影響：每份100 g剪碎的肉桂均浸泡0.5 h，提取時間為6 h，考察加水量為600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1 000 mL時的精油提取量。由圖2可知，加水量為700 mL時，揮發油提取量最多，隨著加水量的增加，肉桂精油提取量變化不大；加水量較少時，提取量較低。加水量少時，產生的水蒸汽較少，從而隨水蒸汽蒸餾出來的油量也少；但加水量太多時，可能是因為芳香水溶液中的油較多，從而使收集到的精油量減弱。

提取時間的影響：每份100 g剪碎的肉桂均浸泡0.5 h，加水700 mL，考察蒸餾時間為4 h、5 h、6 h、7 h、8 h的精油提取量。由圖2可知，提取時間在4～7 h時，隨著提取時間的增加而提取量增加，7 h時提取量較高；隨著時間的進一步延長，略有減少，可能時間太長導致精油揮發損失而減少。

圖2 各因素對肉桂精油提取量的影響

3.3 均勻設計

3.3.1 均勻設計試驗 在單因素試驗之后，設計均勻設計試驗來優化工藝。根據單因素試驗結果設計均勻設計試驗水平。本實驗均勻設計采用3因素5水平：浸泡時間分別為0 min、20 min、40 min、60 min、80 min；蒸餾時間分別為4 h、5 h、6 h、7 h、8 h；加水量分別為6倍量(600 mL)、7倍量(700 mL)、8倍量(800 mL)、9倍量(900 mL)、10倍量(1 000 mL)。因素水平設計見表1。按均勻設計表進行試驗，分別收集精油，量取體積，結果見表2。

表1 U5*(53)均勻設計因素水平

表2 均勻設計試驗結果

表3 回歸模型方差分析結果

表4 回歸模型系數及檢驗結果

3.3.2 驗證實驗 取剪碎的肉桂3份各100 g，均按優選出來的肉桂精油最佳水蒸汽蒸餾提取工藝提取3次，即浸泡20 min，加水量600 mL，提取時間8 h進行水蒸氣蒸餾提取，收集精油量，結果見表5。3次驗證試驗的平均值為1.72 mL，與預測結果接近。所以經均勻設計優選，肉桂抑菌活性部位精油的水蒸氣蒸餾提取工藝為100 g粗粉浸泡20 min，加水量為 600 mL(6倍量)，提取時間為8 h。

表5 驗證試驗結果

3.4 肉桂精油HPLC分析結果

3.4.1 系統適應性考察結果 采用“2.3.3”項下色譜條件進行進樣，對照品及樣品的色譜見圖3，可見在上述色譜條件下，樣品和對照品的色譜分離度較好，無干擾。

3.4.2 肉桂精油的定量分析結果 采用“2.3.3”項下色譜條件進行進樣，樣品中的各成分含量測定結果見表4。由表4可知，肉桂精油中桂皮醛含量高達629.38 mg/g，超過50%；肉桂酸含量為18.76 mg/g。

表6 肉桂精油中肉桂酸與桂皮醛含量結果

4 討論

抑菌活性篩選研究中，雖有文獻[10]報道肉桂精油的抑菌活性，但沒有研究比較肉桂水蒸氣蒸餾時精油與芳香水液的活性。該研究通過抑菌實驗對肉桂水蒸氣蒸餾的提取部位進行抑菌活性篩選，研究發現，主要是精油部位具有抑菌活性，可能與肉桂的主要活性成分桂皮醛有關。文獻[2]報道，桂皮醛具有揮發性，也是肉桂精油中的主要活性成分。在水蒸氣蒸餾過程中，主要活性成分集中于精油中，從而芳香水液沒有體現出抑菌活性。

在提取工藝研究中，經單因素試驗后再采用均勻設計法對肉桂抑菌活性部位精油進行蒸餾優選，獲得其最佳蒸餾提取工藝條件為100 g，肉桂浸泡20 min，加水量為 6倍量(600 mL)，提取時間為8 h。優選出來的工藝經反復驗證可行，可為肉桂精油的蒸餾提取與產品開發提供理論依據。

1-肉桂酸；2-桂皮醛

肉桂精油主要成分分析中，桂皮醛含量高達629.38 mg/g，在精油中超過了50%，充分說明桂皮醛是肉桂精油的主要成分；本研究中的桂皮醛含量與文獻[10]有一定差異，可能與肉桂的產地、采收、加工及生產時間有一定關系。