艾曲泊帕乙醇胺的微生物限度檢查方法適用性研究

段春艷 王以云 王秀艷 胡文紅

摘要：目的：探討艾曲泊帕乙醇胺最合適的微生限度檢查的方法。方法：采用2020版《中國藥典》<1105非無菌產品微生物限度檢查法>中的微生物計數法中的薄膜過濾法和平皿法相結合的方法進行驗證。結果：在驗證條件下，該方法能消除供試品對微生物生長的抑制作用。結論：該方法準確可靠，可用于艾曲泊帕乙醇胺的微生物計數法的檢測。

關鍵詞：微生物計數法;艾曲泊帕乙醇胺;方法驗證

中圖分類號： 文獻標識碼：A

艾曲波帕乙醇胺可用于治療經糖皮質激素類藥物、免疫球蛋白治療無效或脾切除術后慢性特發性血小板減少性紫（ITP）患者的血小板減少。該藥作為ITP二線治療的優選方案，不僅可快速提升血小板數量，便利的口服方式改變了過去以注射為主的治療方式，提升了患者的用藥依從性。

1 材料

（1）儀器與設備 六聯支架過濾裝置（賽多利斯），無菌濾膜（賽多利斯），培養箱（德國賓得），BSC-1304ⅡA2生物安全柜（蘇凈安泰）。

（2）試劑

培養基：胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、 沙氏葡萄糖液體培養基（SDB）。

稀釋液：PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液、中和劑（含3%吐溫80、0.3%卵磷脂、1%皂素的PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液）、含5%吐溫的PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液。

實驗菌種：銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉，均由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法適用性試驗

2.1 菌液的制備

取保存在TSA斜面培養基上的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的培養物適量接種至10 mL 的TSB培養基內，置30～35℃培養18～24小時。取保存在SDA斜面培養基上的白色念珠菌培養物適量接種至10 mL 的SDB培養基中，20～25℃培養2～3天. 取保存在SDA斜面培養基上的黑曲霉培養物至SDA斜面培養基上，20～25℃培養5～7天，加入含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，取上述均勻培養物用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液梯度稀釋制成適宜濃度的菌懸液。

2.2艾曲泊帕乙醇胺的微生物計數法驗證過程

<試驗一>

供試液的制備A組：稱取供試品8克，加入80ml PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，制成1：10的供試液，再取1：10的供試液50ml，加入50ml的PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，制成1;100的供試液。

供試液的制備B組：用中和劑代替PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，其他操作同A組。

試驗組：取1;100的供試液每瓶9.9毫升進行等量分裝，分別加入0.1ml銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液混勻（使每1ml的供試液中含菌量不大于100cfu），取1ml含菌液的供試液置平皿中，傾注15-20ml溫度不超過45度的TSA培養基，于30-35度培養不超過3天，計數。

菌液對照組：取pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9ml/瓶代替供試液，加入0.1ml上述菌液，同試驗組操作培養，進行菌液計數。

供試品對照組：取1：100供試液1ml，分別置無菌平皿中，注入胰酪大豆胨瓊脂培養基15～20ml，待凝固后，32.5℃倒置培養不少于3天進行需氧菌總數的計數;取1：50供試液1ml，分別置無菌平皿中，注入沙氏葡萄糖瓊脂培養基15～20ml，待凝固后，22.5℃倒置培養不少于5天進行霉菌和酵母菌總數的計數，測定供試品本底菌數。

陰性對照組：取pH6.8磷酸鹽緩沖液1ml，按供試品組操作，進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。方法學驗證結果：

方法適用性試驗結果匯總 培養基 陽性菌 陽性菌數 供試品陽性（A組） 供試品陽性（B組）

通過試驗一可得知用pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和用中和劑溶解樣品的回收率都差不多，中和劑也不能消除它的抑菌性，用時也得知配制的1：50的供試液，對白色念珠菌和黑曲霉的抑制性已消除，1;100的供試液對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑制性未消除，因此用PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液擴大到1：500倍，再次驗證回收率。

方法學驗證結果：

3 結論與討論

（1）經驗證取供試品，用PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解并制成1：10的供試液，再用PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋得到1：50的供試液和1：100的供試液，取1：100的供試液稀釋靜止10分鐘，取上清液1ml，采用薄膜過濾法，用PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗5次（每次100ml），進行艾曲泊帕乙醇胺需氧菌總數的計數，取1：50的供試液1ml，用平皿法進行艾曲泊帕乙醇胺霉菌及酵母菌總數的計數，方法學驗證合適。

（2）討論

艾曲泊帕乙醇胺的需氧菌總數的限制為103cfu，可接受的最大菌數為2000，如果用1：1000的供試液檢測，置信度偏低，可采用薄膜過濾法進行需氧菌總數的檢測。因此該方法適用于艾曲泊帕乙醇胺的微生物限度需氧菌總數的檢查。

參考文獻：

[1]吳偉平，陳宇堃，梁蔚陽，余燕.他克莫司膠囊微生物限度檢查方法的建立[J].中國藥瓶標準，2020，

[2]中華人民共和國藥典2020年版.四部1105：164