駝奶中乳酸菌的分離鑒定

任冬艷 李磊 李翠平 孫潔宇 韓毅峰 閆繼彪

摘 要：采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法對(duì)內(nèi)蒙古阿拉善地區(qū)的駝奶進(jìn)行乳酸菌的分離純化，運(yùn)用16S rRNA測序技術(shù)對(duì)其種屬進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，經(jīng)16S rRNA基因序列分析，將分離到的7株乳酸菌鑒定為3個(gè)屬，4個(gè)種，分別為3株Lactococcus lactis，2株Enterococcus gilvus，1株Lactobacillus paracasei，1株Leuconostoc mesenteroides。其中，Lactococcus lactis為樣品的優(yōu)勢(shì)菌種。

關(guān)鍵詞：乳酸菌;多樣性;16S rRNA基因序列分析;駝奶

Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Camel Milk

REN Dongyan， LI Lei， LI Cuiping， SUN Jieyu， HAN Yifeng， YAN Jibiao

（Inner Mongolia Puze Biological Products Limited liability Company， Hohhot 010080， China）

Abstract： In this study， a camel milk collected from Alxa area of Inner Mongolia were isolated and purified lactic acid bacteria by traditional pure culture method. The 16S rRNA sequence analysis and phylogenetic evolutionary relationship were used to identify the species. The results showed that 7 strains of lactobacillus isolated were identified as 3 genera and 4 species by 16S rRNA gene sequence analysis. 7 isolates were identified to 3 strains of Lactococcus lactis， 2 strains of Enterococcus gilvus， 1 strains of Lactobacillus paracasei， 1 strains of Leuconostoc mesenteroides， Lactococcus lactis is the dominant species.

Keywords： lactic acid bacteria; diversity; 16S rRNA gene sequencing; camel milk

駱駝是我國西北和華北荒漠、半荒漠地區(qū)的重要畜種資源之一，也是這一地區(qū)草原畜牧業(yè)的重要組成部分。駝乳素有“沙漠白金”的美譽(yù)，作為一種營養(yǎng)價(jià)值較高的食物，駝乳雖然已經(jīng)得到了世界上多數(shù)國家的認(rèn)可，但是在日常生活中，人們對(duì)于駝乳依然并不熟悉，其食用并不廣泛。經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)測定，駝乳中含有大量的維生素B、C以及礦物元素，因此，駝乳以其豐富的營養(yǎng)被許多人們所青睞。由于駝乳越來越被人們所熟知，市場中駝乳的需求量增加，為游牧民族的人們帶來了新的收入增長點(diǎn)。

采用16S rRNA基因序列方法對(duì)乳酸菌進(jìn)行分類，已經(jīng)成為當(dāng)今使用最多的方法。研究微生物的種類有利于發(fā)掘生物多樣性、微生物類群多樣性、生態(tài)類型多樣性、遺傳多樣性。本研究對(duì)采自內(nèi)蒙古阿拉善地區(qū)的駝奶樣品中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，對(duì)菌種資源的挖掘和保護(hù)具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 駝奶樣品來源

新鮮駝奶樣品采自內(nèi)蒙古阿拉善牧民家庭。將樣品置于無菌容器內(nèi)，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、M17固體培養(yǎng)基、M17液體培養(yǎng)基，由深市環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。

試劑：PBS緩沖液、脫脂乳保護(hù)劑、細(xì)菌DNA提取試劑盒PCR擴(kuò)增和電泳所用試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品收集

收集樣品采用直接取樣法。采集樣品并對(duì)樣品進(jìn)行編號(hào)標(biāo)注，于4 ℃便攜式冰箱內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室待研究。

1.2.2 樣品分離

結(jié)合乳酸菌的特性選擇較為合理的分離方法，根據(jù)相關(guān)理論可知，涂布法是較為合適的方法。取駝乳加生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，然后吸取0.2 mL合適的稀釋液分別涂在兩種固體培養(yǎng)基上，然后將涂有固體培養(yǎng)基的平板放置在培養(yǎng)箱內(nèi)厭氧培養(yǎng)48 h。菌落形成后，隨機(jī)挑取出形態(tài)特征不同的革蘭氏染色陽性單個(gè)菌落于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上劃線分離，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，如此反復(fù)純化3～4次，轉(zhuǎn)移至相應(yīng)液體培養(yǎng)基中增殖，進(jìn)行純化培養(yǎng)。對(duì)純化好的菌液進(jìn)行保藏。

1.2.3 基因組DNA提取及16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

用TIANampBacteria DNA Kit提取基因組DNA，用ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)測其濃度和OD260/280值。

PCR擴(kuò)增體系：5 μL Easy Taq Buffer（Mg2+）;4 μL High Pure d NTPs（2.5 mmol/L）;1.5 μL引物FA-27F（濃度為10 mmol/L）;1.5 μL引物RA-1495R（濃度10 mmol/L）;0.5 μL Easy Taq DNA polymerase（5 U/μL）;2 μL DNA模板（質(zhì)量濃度100 ng/μL）;35.5 μL H2O。PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物。

PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃末端延伸10 min。

1.2.4 16S rRNA序列測定和同源性分析

將PCR產(chǎn)物送到派森諾生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序，運(yùn)用DNAStar 6.1軟件包中的SeqMan軟件將其進(jìn)行拼接，最終獲得1 400 bp的有效序列。利用Blast軟件將測定的序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知分類地位的乳酸菌基因序列進(jìn)行同源性比較，應(yīng)用軟件Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離株的菌落形態(tài)

根據(jù)菌落的形態(tài)特征、革蘭氏染色結(jié)果和過氧化氫酶試驗(yàn)，將從駝奶中分離到的7株菌株初步定為乳酸菌。在固體培養(yǎng)基上菌落形狀呈圓形，中心凸起，邊緣整齊，表面光滑或者粗糙，顏色為白色或乳白色。

2.2 乳酸菌基因提取結(jié)果和16S rDNA的擴(kuò)增結(jié)果

由圖1可知，用微量紫外分光光度計(jì)測定提取得到乳酸菌菌株基因組DNA，所有分離株DNA的純度值（A260/A280）都在1.8～2.0，濃度范圍在100～3 000 ng/μL，分離株基因組DNA是滿足后續(xù)試驗(yàn)要求的。由于不存在非特異性擴(kuò)增，因此可以判斷菌株16S rDNA符合條件，可以進(jìn)行后續(xù)的操作，即送到指定單位進(jìn)行純化以及測序。

2.3 同源性分析

由圖2所示，菌株T2、T9和T12與模式株Lactococcus lactis ATCC 19435聚在一起，同源性為99%，可歸為Lactococcus lactis。T4和T10與模式株Enterococcus gilvus ATCC BAA-350聚類，同源性為97%，可歸為Enterococcus gilvus。T5和模式株Lactobacillus paracasei ATCC 25302（D79212）聚類，同源性為99%，可歸為Lactobacillus paracasei。T8和模式株Leuconostoc mesenteroides NCFB529聚類，同源性為98%，故鑒定為Leuconostoc mesenteroides。

3 結(jié)論

本研究從駝奶中分離出的乳酸菌一共有7株，經(jīng)過一系列的分析以及測定可以判斷這7株乳酸菌為3個(gè)屬4個(gè)種，包括2株Enterococcus gilvus，1株Lactobacillus paracasei，1株Leuconostoc mesenteroides，3株Lactococcus lactis，該樣品多樣性較為豐富，Lactococcus lactis為優(yōu)勢(shì)菌種。

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