PCR-反向點雜交法檢測復(fù)治涂陽患者結(jié)核分枝桿菌耐藥性的價值

劉輊彬 吳敏 吳小翠 韓敏 肖和平 張青

我國結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病防控形勢依然嚴(yán)峻[1]，復(fù)治肺結(jié)核耐藥率遠(yuǎn)高于初治肺結(jié)核[2-3]，從復(fù)治肺結(jié)核患者中快速檢出耐藥的結(jié)核分枝桿菌(MTB)，指導(dǎo)臨床選擇有效的抗結(jié)核藥品，制定合理的化療方案，是治療復(fù)治及耐藥結(jié)核病的關(guān)鍵[4]。目前臨床廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)操作復(fù)雜、耗時長，不能為臨床提供時效性檢測結(jié)果[5-6]。PCR-反向點雜交法可同時快速檢測MTB對多種抗結(jié)核藥品的耐藥性，整個檢測過程只需1～2 d，已有文獻(xiàn)報道該方法對臨床標(biāo)本具有較高的檢測效能，但基于社會經(jīng)濟等因素，目前該方法仍無法廣泛應(yīng)用于所有肺結(jié)核人群。本研究以耐藥率較高的復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者為研究對象，以微孔板法藥敏試驗為參考標(biāo)準(zhǔn)，探討PCR-反向點雜交法檢測復(fù)治涂陽患者痰標(biāo)本中MTB耐藥性的價值。

材料和方法

一、材料收集

收集2015年6月至2019年1月上海市肺科醫(yī)院診治的400例復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者作為研究對象，包括初治失敗、規(guī)則用藥滿療程后痰菌復(fù)陽、不規(guī)則化療超過1個月以及慢性排菌的患者，其中男279例，女121例，平均年齡(42.52±14.66)歲。收集患者晨起漱口后的痰液標(biāo)本，每份標(biāo)本量均不少于2 ml，經(jīng)熒光染色涂片鏡檢，收集涂片陽性標(biāo)本共400例(份)。每例患者采用同一標(biāo)本進行PCR-反向點雜交法MTB耐藥基因檢測、GeneXpert MTB/RIF檢測和BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)、菌種鑒定、微孔板法藥敏試驗。除外23例培養(yǎng)污染或陰性標(biāo)本，獲得培養(yǎng)陽性菌株377株，經(jīng)菌種鑒定，排除9例非結(jié)核分枝桿菌，共計368例MTB分離株進行微孔板法藥敏試驗，其中5例未獲得藥敏試驗結(jié)果，6例PCR-反向點雜交法檢測陰性或結(jié)果無法判讀，最終357例(株)納入研究。

二、檢測方法

1.標(biāo)本前處理：痰標(biāo)本經(jīng)N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH消化液處理15 min，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)至40 ml，4 ℃ 3000×g離心20 min，棄上清液，沉淀加入2 ml PBS振蕩重懸。

2.PCR-反向點雜交法MTB耐藥基因檢測：應(yīng)用亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司的MTB耐藥突變基因檢測試劑盒(PCR-反向點雜交法)檢測痰標(biāo)本中MTB耐藥相關(guān)基因(利福平耐藥基因rpoB、異煙肼耐藥基因katG和inhA、鏈霉素耐藥基因rpsL、乙胺丁醇耐藥基因embB)。取1 ml上述重懸液，根據(jù)試劑盒的操作說明進行標(biāo)本處理、試劑配置、DNA提取、PCR擴增、雜交、洗膜、顯色、結(jié)果判讀。陽性質(zhì)量控制樣品正常顯色而臨床樣本只有 CC 位點顯色，表明被檢樣本中無MTB或者樣本中待檢測的MTB在本試劑盒最低檢出限以下。膜條上探針位點排列見圖1。

3.GeneXpert MTB/RIF檢測：取0.5 ml上述重懸液，加入含異丙醇的處理液至3 ml，在漩渦器上劇烈振蕩10～15次，在室溫下靜置15 min，用無菌移液管吸取2 ml樣本加入到Cartridge反應(yīng)盒內(nèi)，放入GeneXpert儀器(美國Cepheid公司生產(chǎn))中進行檢測。儀器設(shè)有A、B、C、D、E 5條相互重疊的分子探針，能夠與MTB的rpoB基因利福平耐藥核心區(qū)81 bp結(jié)合并完全覆蓋，對5條熒光探針循環(huán)閾值(Ct值)進行檢測，如果5條熒光探針Ct值均≤40且任意2條探針Ct值(最早期的Ct值和晚期的Ct值之差)<3.5，則判定為MTB陽性且對利福平敏感；如果任意2條探針Ct值≥3.5，則判定為利福平耐藥基因突變；如果有3條及以上熒光探針Ct值均>40，則判斷為未檢測到MTB。

4.BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)、菌種鑒定、微孔板法藥敏試驗：取剩余上述重懸液，按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[7]進行BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性菌株應(yīng)用對硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)鑒別培養(yǎng)基生長試驗進行菌種鑒定，鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分離株采用美國賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Fisher Scientific)的分枝桿菌藥敏檢測板Sensititre?MYCOTB進行藥敏試驗，具體操作方法按照說明書進行。利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥濃度分別為8 μg/ml、2 μg/ml、8 μg/ml、5 μg/ml。

注：(1)第一排N代表該位點為野生型，第二排是突變位點，其中后2個探針的M代表突變探針。第一排N1到N5和第二排的前6個位點(D516V到S531W)是利福平耐藥相關(guān)基因rpoB檢測探針；其他的315和-15位點分別是異煙肼的耐藥相關(guān)基因katG和inhA檢測探針。(2)516代表相關(guān)基因(這里是rpoB)上第516個氨基酸，其他位點類同。(3)在rpoB基因相關(guān)位點中，N1探針覆蓋的位點有511和513及附近區(qū)域位點，即若正常位點中只有N1位點不顯色，則表明有511、513或附近區(qū)域位點發(fā)生了突變，其他位點類同；以下是幾個正常探針覆蓋到的位點及附近區(qū)域：N1：511、513；N2：516、519；N3：522、523；N4：526、529；N5：531、533。(4)突變位點的氨基酸變化：D516V即D突變成V，代表天冬氨酸突變成纈氨酸；其他氨基酸含義G-甘氨酸、H-組氨酸、Y-酪氨酸、S-絲氨酸、L-亮氨酸、W-色氨酸、下蘇氨酸、N-天冬氨酸。(5)第三排43N、88N代表鏈霉素rpsL基因43和88密碼子位點為野生型，43M、88M代表鏈霉素rpsL基因相應(yīng)位點發(fā)生突變。(6)第三排306N代表乙胺丁醇embB基因306位點為野生型，306M1、306M2、306M3代表乙胺丁醇embB基因位點發(fā)生不同類型的突變

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，以微孔板法藥敏試驗結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，計算PCR-反向點雜交法和GeneXpert MTB/RIF檢測MTB對不同藥品耐藥性的檢測效能，各項指標(biāo)計算方法：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致性分析采用Kappa檢驗，Kappa值在0.41～0.60為中等一致，0.61～0.80為基本一致，0.81～1.00為幾乎完全一致。

結(jié) 果

一、MTB對利福平耐藥性的檢測

以微孔板法藥敏試驗結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，PCR-反向點雜交法檢測MTB對利福平耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和符合率分別為97.5%(115/118)、97.1%(232/239)、94.3%(115/122)、98.7%(232/235)和97.2%(347/357)，一致性分析為幾乎完全一致(Kappa值=0.937)；GeneXpert MTB/RIF檢測MTB對利福平耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和符合率分別為95.8%(113/118)、95.8%(229/239)、91.9%(113/123)、97.9%(229/234)和95.8%(242/357)，一致性分析為幾乎完全一致(Kappa值=0.906)，見表1。

二、MTB對異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥性的檢測

以微孔板法藥敏試驗結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，PCR-反向點雜交法檢測MTB對異煙肼耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和符合率分別為82.5%(113/137)、99.1%(218/220)、98.3%(113/115)、90.1%(218/242)和92.7%(331/357)，一致性分析為幾乎完全一致(Kappa值=0.841)；對鏈霉素耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和符合率分別為86.5%(115/133)、99.1%(222/224)、98.3%(115/117)、92.5%(222/240)和94.4%(337/357)，一致性分析為幾乎完全一致(Kappa值=0.877)；對乙胺丁醇耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和符合率分別為60.7%(37/61)、98.6%(292/296)、90.2%(37/41)、92.4%(292/316)和92.2%(329/357)，一致性分析為基本一致(Kappa值=0.682)，見表2。

表1 以微孔板法藥敏試驗結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)PCR-反向點雜交法和Gene Xpert MTB/RIF檢測MTB對利福平耐藥性的效能

表2 以微孔板法藥敏試驗結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)評價PCR-反向點雜交法檢測MTB對異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥性的效能

討 論

分子藥敏試驗已成為耐藥結(jié)核病的確診方法之一[3,8-9]，《結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測專家共識》建議在進行傳統(tǒng)培養(yǎng)和表型藥敏試驗的同時采用分子藥敏試驗方法直接檢測涂片陽性的臨床標(biāo)本[10]。PCR-反向點雜交法是將高敏感度的PCR技術(shù)和高通量的反向點雜交技術(shù)相結(jié)合的基因檢測技術(shù)，可同時快速檢測臨床標(biāo)本中MTB對多種抗結(jié)核藥品的耐藥性。

本研究顯示，以微孔板法藥敏試驗結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，PCR-反向點雜交法對復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTB耐藥性有較好的檢測效能，對4種一線抗結(jié)核藥品耐藥性的特異度均在95%以上，陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和符合率均在90%以上。

本研究PCR-反向點雜交法檢測MTB對利福平耐藥性的敏感度和特異度分別為97.5%和97.1%，高于GeneXpert MTB/RIF檢測MTB對利福平耐藥性的敏感度和特異度(95.8%和95.8%)，PCR-反向點雜交法和 Gene Xpert MTB/RIF與微孔板法藥敏試驗結(jié)果一致性均較好(Kappa值分別為0.937和0.906)，但PCR-反向點雜交法與微孔板法藥敏試驗結(jié)果的一致性更高，原因可能是當(dāng)待測標(biāo)本同時存在敏感和耐藥細(xì)菌時，GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)易將結(jié)果判斷為野生型，從而導(dǎo)致耐藥菌的漏檢[11]。

本研究PCR-反向點雜交法檢測MTB對異煙肼耐藥性的敏感度和Kappa值分別為82.5%和0.841，均高于林明冠等[12]的研究結(jié)果(77.5%和0.634)。我國結(jié)核病患者中，對異煙肼有70%～80%的耐藥率是由于katG315位密碼子突變所致，表型藥敏試驗通常表現(xiàn)為MTB對異煙肼低、中水平耐受或敏感；10%左右患者MTB分離株中的katG完全缺失，一般會導(dǎo)致MTB對異煙肼的高水平耐藥[13]。

施伎蟬等[14]以BACTEC MGIT 960藥敏試驗為參考標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用反向斑點雜交技術(shù)檢測復(fù)治肺結(jié)核患者痰標(biāo)本MTB鏈霉素耐藥性的敏感度和特異度分別為75.0%和96.9%，其敏感度低于本研究的結(jié)果(86.5%)，特異度與本研究結(jié)果(99.1%)相近。原因可能與不同地區(qū)流行的MTB菌株的耐藥基因型并不完全相同、樣本量及檢測水平及參考標(biāo)準(zhǔn)不同等因素有關(guān)。

對乙胺丁醇耐藥基因突變的檢測結(jié)果顯示，以微孔板法藥敏試驗為參考標(biāo)準(zhǔn)，PCR-反向點雜交法檢測結(jié)果與其符合率高(92.2%)，特異度高(98.6%)，但敏感度和Kappa值只有60.7%和0.682，可能原因為本研究試劑盒檢測未能覆蓋所有對乙胺丁醇耐藥的突變位點。embB306位密碼子是最常見的突變位點，但只有47%～89%的耐乙胺丁醇的MTB有embB306位密碼子突變[10]；此外，embB406和embB497也是較常見的突變位點[10]，而本研究采用的試劑盒并未具備對這些突變位點的檢測功能。

本次研究顯示PCR-反向點雜交法也存在一定不足，對于部分陽性標(biāo)本出現(xiàn)檢測結(jié)果無效。樣本處理是結(jié)核病分子生物學(xué)診斷的關(guān)鍵[15]，如果原始標(biāo)本含有較大比例的血液或者食物殘渣等雜質(zhì)時，核酸提取過程中未經(jīng)過有效的前處理會導(dǎo)致所提取的核酸模板純度不足，出現(xiàn)反應(yīng)抑制。當(dāng)標(biāo)本MTB含量較低時，樣本中待檢測的MTB在本試劑盒最低檢出限以下，即≤1.0×104拷貝/ml，可能出現(xiàn)結(jié)果無法判讀的現(xiàn)象。此外，尚需預(yù)防擴增產(chǎn)物污染而導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。