PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)復(fù)治涂陽患者結(jié)核分枝桿菌耐藥性的價(jià)值

劉輊彬 吳敏 吳小翠 韓敏 肖和平 張青

我國(guó)結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻[1]，復(fù)治肺結(jié)核耐藥率遠(yuǎn)高于初治肺結(jié)核[2-3]，從復(fù)治肺結(jié)核患者中快速檢出耐藥的結(jié)核分枝桿菌(MTB)，指導(dǎo)臨床選擇有效的抗結(jié)核藥品，制定合理的化療方案，是治療復(fù)治及耐藥結(jié)核病的關(guān)鍵[4]。目前臨床廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，不能為臨床提供時(shí)效性檢測(cè)結(jié)果[5-6]。PCR-反向點(diǎn)雜交法可同時(shí)快速檢測(cè)MTB對(duì)多種抗結(jié)核藥品的耐藥性，整個(gè)檢測(cè)過程只需1～2 d，已有文獻(xiàn)報(bào)道該方法對(duì)臨床標(biāo)本具有較高的檢測(cè)效能，但基于社會(huì)經(jīng)濟(jì)等因素，目前該方法仍無法廣泛應(yīng)用于所有肺結(jié)核人群。本研究以耐藥率較高的復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，以微孔板法藥敏試驗(yàn)為參考標(biāo)準(zhǔn)，探討PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)復(fù)治涂陽患者痰標(biāo)本中MTB耐藥性的價(jià)值。

材料和方法

一、材料收集

收集2015年6月至2019年1月上海市肺科醫(yī)院診治的400例復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，包括初治失敗、規(guī)則用藥滿療程后痰菌復(fù)陽、不規(guī)則化療超過1個(gè)月以及慢性排菌的患者，其中男279例，女121例，平均年齡(42.52±14.66)歲。收集患者晨起漱口后的痰液標(biāo)本，每份標(biāo)本量均不少于2 ml，經(jīng)熒光染色涂片鏡檢，收集涂片陽性標(biāo)本共400例(份)。每例患者采用同一標(biāo)本進(jìn)行PCR-反向點(diǎn)雜交法MTB耐藥基因檢測(cè)、GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)和BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)、菌種鑒定、微孔板法藥敏試驗(yàn)。除外23例培養(yǎng)污染或陰性標(biāo)本，獲得培養(yǎng)陽性菌株377株，經(jīng)菌種鑒定，排除9例非結(jié)核分枝桿菌，共計(jì)368例MTB分離株進(jìn)行微孔板法藥敏試驗(yàn)，其中5例未獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果，6例PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)陰性或結(jié)果無法判讀，最終357例(株)納入研究。

二、檢測(cè)方法

1.標(biāo)本前處理：痰標(biāo)本經(jīng)N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH消化液處理15 min，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)至40 ml，4 ℃ 3000×g離心20 min，棄上清液，沉淀加入2 ml PBS振蕩重懸。

2.PCR-反向點(diǎn)雜交法MTB耐藥基因檢測(cè)：應(yīng)用亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司的MTB耐藥突變基因檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)檢測(cè)痰標(biāo)本中MTB耐藥相關(guān)基因(利福平耐藥基因rpoB、異煙肼耐藥基因katG和inhA、鏈霉素耐藥基因rpsL、乙胺丁醇耐藥基因embB)。取1 ml上述重懸液，根據(jù)試劑盒的操作說明進(jìn)行標(biāo)本處理、試劑配置、DNA提取、PCR擴(kuò)增、雜交、洗膜、顯色、結(jié)果判讀。陽性質(zhì)量控制樣品正常顯色而臨床樣本只有 CC 位點(diǎn)顯色，表明被檢樣本中無MTB或者樣本中待檢測(cè)的MTB在本試劑盒最低檢出限以下。膜條上探針位點(diǎn)排列見圖1。

3.GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)：取0.5 ml上述重懸液，加入含異丙醇的處理液至3 ml，在漩渦器上劇烈振蕩10～15次，在室溫下靜置15 min，用無菌移液管吸取2 ml樣本加入到Cartridge反應(yīng)盒內(nèi)，放入GeneXpert儀器(美國(guó)Cepheid公司生產(chǎn))中進(jìn)行檢測(cè)。儀器設(shè)有A、B、C、D、E 5條相互重疊的分子探針，能夠與MTB的rpoB基因利福平耐藥核心區(qū)81 bp結(jié)合并完全覆蓋，對(duì)5條熒光探針循環(huán)閾值(Ct值)進(jìn)行檢測(cè)，如果5條熒光探針Ct值均≤40且任意2條探針Ct值(最早期的Ct值和晚期的Ct值之差)<3.5，則判定為MTB陽性且對(duì)利福平敏感；如果任意2條探針Ct值≥3.5，則判定為利福平耐藥基因突變；如果有3條及以上熒光探針Ct值均>40，則判斷為未檢測(cè)到MTB。

4.BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)、菌種鑒定、微孔板法藥敏試驗(yàn)：取剩余上述重懸液，按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[7]進(jìn)行BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性菌株應(yīng)用對(duì)硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)鑒別培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定，鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分離株采用美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Fisher Scientific)的分枝桿菌藥敏檢測(cè)板Sensititre?MYCOTB進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，具體操作方法按照說明書進(jìn)行。利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥濃度分別為8 μg/ml、2 μg/ml、8 μg/ml、5 μg/ml。

注：(1)第一排N代表該位點(diǎn)為野生型，第二排是突變位點(diǎn)，其中后2個(gè)探針的M代表突變探針。第一排N1到N5和第二排的前6個(gè)位點(diǎn)(D516V到S531W)是利福平耐藥相關(guān)基因rpoB檢測(cè)探針；其他的315和-15位點(diǎn)分別是異煙肼的耐藥相關(guān)基因katG和inhA檢測(cè)探針。(2)516代表相關(guān)基因(這里是rpoB)上第516個(gè)氨基酸，其他位點(diǎn)類同。(3)在rpoB基因相關(guān)位點(diǎn)中，N1探針覆蓋的位點(diǎn)有511和513及附近區(qū)域位點(diǎn)，即若正常位點(diǎn)中只有N1位點(diǎn)不顯色，則表明有511、513或附近區(qū)域位點(diǎn)發(fā)生了突變，其他位點(diǎn)類同；以下是幾個(gè)正常探針覆蓋到的位點(diǎn)及附近區(qū)域：N1：511、513；N2：516、519；N3：522、523；N4：526、529；N5：531、533。(4)突變位點(diǎn)的氨基酸變化：D516V即D突變成V，代表天冬氨酸突變成纈氨酸；其他氨基酸含義G-甘氨酸、H-組氨酸、Y-酪氨酸、S-絲氨酸、L-亮氨酸、W-色氨酸、下蘇氨酸、N-天冬氨酸。(5)第三排43N、88N代表鏈霉素rpsL基因43和88密碼子位點(diǎn)為野生型，43M、88M代表鏈霉素rpsL基因相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生突變。(6)第三排306N代表乙胺丁醇embB基因306位點(diǎn)為野生型，306M1、306M2、306M3代表乙胺丁醇embB基因位點(diǎn)發(fā)生不同類型的突變

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以微孔板法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算PCR-反向點(diǎn)雜交法和GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)MTB對(duì)不同藥品耐藥性的檢測(cè)效能，各項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算方法：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值在0.41～0.60為中等一致，0.61～0.80為基本一致，0.81～1.00為幾乎完全一致。

結(jié) 果

一、MTB對(duì)利福平耐藥性的檢測(cè)

以微孔板法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率分別為97.5%(115/118)、97.1%(232/239)、94.3%(115/122)、98.7%(232/235)和97.2%(347/357)，一致性分析為幾乎完全一致(Kappa值=0.937)；GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率分別為95.8%(113/118)、95.8%(229/239)、91.9%(113/123)、97.9%(229/234)和95.8%(242/357)，一致性分析為幾乎完全一致(Kappa值=0.906)，見表1。

二、MTB對(duì)異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥性的檢測(cè)

以微孔板法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)MTB對(duì)異煙肼耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率分別為82.5%(113/137)、99.1%(218/220)、98.3%(113/115)、90.1%(218/242)和92.7%(331/357)，一致性分析為幾乎完全一致(Kappa值=0.841)；對(duì)鏈霉素耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率分別為86.5%(115/133)、99.1%(222/224)、98.3%(115/117)、92.5%(222/240)和94.4%(337/357)，一致性分析為幾乎完全一致(Kappa值=0.877)；對(duì)乙胺丁醇耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率分別為60.7%(37/61)、98.6%(292/296)、90.2%(37/41)、92.4%(292/316)和92.2%(329/357)，一致性分析為基本一致(Kappa值=0.682)，見表2。

表1 以微孔板法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)PCR-反向點(diǎn)雜交法和Gene Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的效能

表2 以微孔板法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)MTB對(duì)異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥性的效能

討 論

分子藥敏試驗(yàn)已成為耐藥結(jié)核病的確診方法之一[3,8-9]，《結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)專家共識(shí)》建議在進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)和表型藥敏試驗(yàn)的同時(shí)采用分子藥敏試驗(yàn)方法直接檢測(cè)涂片陽性的臨床標(biāo)本[10]。PCR-反向點(diǎn)雜交法是將高敏感度的PCR技術(shù)和高通量的反向點(diǎn)雜交技術(shù)相結(jié)合的基因檢測(cè)技術(shù)，可同時(shí)快速檢測(cè)臨床標(biāo)本中MTB對(duì)多種抗結(jié)核藥品的耐藥性。

本研究顯示，以微孔板法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，PCR-反向點(diǎn)雜交法對(duì)復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTB耐藥性有較好的檢測(cè)效能，對(duì)4種一線抗結(jié)核藥品耐藥性的特異度均在95%以上，陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率均在90%以上。

本研究PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的敏感度和特異度分別為97.5%和97.1%，高于GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的敏感度和特異度(95.8%和95.8%)，PCR-反向點(diǎn)雜交法和 Gene Xpert MTB/RIF與微孔板法藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致性均較好(Kappa值分別為0.937和0.906)，但PCR-反向點(diǎn)雜交法與微孔板法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的一致性更高，原因可能是當(dāng)待測(cè)標(biāo)本同時(shí)存在敏感和耐藥細(xì)菌時(shí)，GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)易將結(jié)果判斷為野生型，從而導(dǎo)致耐藥菌的漏檢[11]。

本研究PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)MTB對(duì)異煙肼耐藥性的敏感度和Kappa值分別為82.5%和0.841，均高于林明冠等[12]的研究結(jié)果(77.5%和0.634)。我國(guó)結(jié)核病患者中，對(duì)異煙肼有70%～80%的耐藥率是由于katG315位密碼子突變所致，表型藥敏試驗(yàn)通常表現(xiàn)為MTB對(duì)異煙肼低、中水平耐受或敏感；10%左右患者M(jìn)TB分離株中的katG完全缺失，一般會(huì)導(dǎo)致MTB對(duì)異煙肼的高水平耐藥[13]。

施伎蟬等[14]以BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn)為參考標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)復(fù)治肺結(jié)核患者痰標(biāo)本MTB鏈霉素耐藥性的敏感度和特異度分別為75.0%和96.9%，其敏感度低于本研究的結(jié)果(86.5%)，特異度與本研究結(jié)果(99.1%)相近。原因可能與不同地區(qū)流行的MTB菌株的耐藥基因型并不完全相同、樣本量及檢測(cè)水平及參考標(biāo)準(zhǔn)不同等因素有關(guān)。

對(duì)乙胺丁醇耐藥基因突變的檢測(cè)結(jié)果顯示，以微孔板法藥敏試驗(yàn)為參考標(biāo)準(zhǔn)，PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)結(jié)果與其符合率高(92.2%)，特異度高(98.6%)，但敏感度和Kappa值只有60.7%和0.682，可能原因?yàn)楸狙芯吭噭┖袡z測(cè)未能覆蓋所有對(duì)乙胺丁醇耐藥的突變位點(diǎn)。embB306位密碼子是最常見的突變位點(diǎn)，但只有47%～89%的耐乙胺丁醇的MTB有embB306位密碼子突變[10]；此外，embB406和embB497也是較常見的突變位點(diǎn)[10]，而本研究采用的試劑盒并未具備對(duì)這些突變位點(diǎn)的檢測(cè)功能。

本次研究顯示PCR-反向點(diǎn)雜交法也存在一定不足，對(duì)于部分陽性標(biāo)本出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果無效。樣本處理是結(jié)核病分子生物學(xué)診斷的關(guān)鍵[15]，如果原始標(biāo)本含有較大比例的血液或者食物殘?jiān)入s質(zhì)時(shí)，核酸提取過程中未經(jīng)過有效的前處理會(huì)導(dǎo)致所提取的核酸模板純度不足，出現(xiàn)反應(yīng)抑制。當(dāng)標(biāo)本MTB含量較低時(shí)，樣本中待檢測(cè)的MTB在本試劑盒最低檢出限以下，即≤1.0×104拷貝/ml，可能出現(xiàn)結(jié)果無法判讀的現(xiàn)象。此外，尚需預(yù)防擴(kuò)增產(chǎn)物污染而導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。