兩種技術對結核性膿胸不同手術標本病原學及耐藥性檢測結果分析

李潛 汪林寶 羅佩嘉 韋林 劉玉鋼 任磊鵬 丁超

目前，表型藥物敏感性試驗(簡稱“表型藥敏試驗”)仍是檢測MTB耐藥性的主要方法，但結果報告時間較長，如BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)培養的平均時間為18 d[1]；而研究較多的基因芯片和測序技術具有檢測敏感度高，儀器試劑成本也高[2]的特點，不利于基層推廣使用；故具有較高敏感度及特異度的熒光PCR熔解曲線法(real-time PCR melt curve，簡稱“PCR熔解曲線法”)成為技術成本較低且檢測速度較快的新型檢測MTB耐藥性的應用技術[3-4]。結核性膿胸常規采用手術治療及手術前后規范抗結核治療，但術前病灶標本的采集、檢測方法的選擇成為影響MTB培養陽性率、耐藥篩查率和患者手術前后抗結核治療有效性的關鍵[5]。為進一步探討PCR熔解曲線法在結核性膿胸術中標本快速耐藥篩查中的應用價值，本研究分析150例結核性膿胸患者的相關臨床資料，為臨床診治提供參考。

對象和方法

一、 研究對象

搜集2019年1月至2020年6月符合入組標準的150例結核性膿胸患者不同手術標本(組織和膿液)，分別送檢MGIT 960培養陽性后行表型藥敏試驗、PCR熔解曲線法核酸檢測陽性后行耐藥基因檢測，比較兩種方法對結核性膿胸不同手術標本病原學及耐藥性的檢出率。其中男120例，女30例；年齡10～68歲，中位年齡為26歲；左側65例，右側85例，無雙側；病程1～120個月，中位病程為4個月；術前抗結核藥品治療時間為1～36個月，中位治療時間為3個月。手術標本均來自膿胸病灶清除術及胸膜剝脫術切開病灶時即刻采集的膿液和組織標本，各150份。

結核性膿胸確診依據(符合其一即可)：(1)術前胸腔穿刺標本MTB MGIT 960培養陽性且MPB64單克隆抗體測定為MTB菌株；(2)組織病理檢查表現為典型結核肉芽腫性炎伴干酪樣壞死。

二、 術中標本檢測方法

1.MGIT 960培養：采用BACTEC MGIT 960液體培養系統，參照《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質量保證手冊》[6]操作。術中標本(組織、膿液)靜置后取 2～3 ml 沉淀樣本加入 1～2 倍體積的4%NaOH，渦旋振蕩2～3 次，室溫靜置15 min，加PBS緩沖液至40 ml，離心后棄上清加入1.5 ml PBS 緩沖液，振蕩混勻放置10 min后取0.5 ml加入BACTEC MGIT 960液體培養管中，放入BACTEC MGIT 960液體培養系統進行培養。

2.MGIT 960表型藥敏試驗：將MGIT 960培養陽性的術中標本接種至MGIT 960管進行異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星藥敏試驗[7]。

3.MTB PCR熔解曲線法核酸檢測：取1～3 ml標本量，置無菌管內加入2～3倍體積的4%NaOH溶液，37 ℃恒溫處理30 min，使其充分液化(無明顯固狀物且吸出時無拖絲現象)。取1 ml消化液加入到相應編號的1.5 ml無菌離心管中，15 000×g離心5 min。去上清液，沉淀加入無菌生理鹽水1 ml打勻，15 000×g離心5 min；再重復洗滌1次。留取沉淀進行DNA提取。

以下操作按照中山大學達安基因公司提供的試劑盒說明進行，擴增用BIORAD-CFX96熒光定量擴增儀。取3～5 ml標本量于無菌管內，2000×g離心1 min，取上清液1 ml加入到1.5 ml無菌離心管中，15 000×g離心5 min；吸去上液，留100 μl；再加入1 ml，重復離心1次，去上清液留沉淀進行DNA提取，篩選出核酸陽性標本后送檢熔解曲線法檢測。標本當天不進行檢測時，置2～8 ℃冰箱保存。結果判定：Ct值(即循環閾值)<40定義為陽性，可送PCR熔解曲線檢測，但因30≤Ct值<40結果誤差較多，本研究將其納入陰性統計；Ct值≥40定義為陰性，不進行PCR熔解曲線檢測。

4.PCR熔解曲線法耐藥基因檢測：由廈門致善生物科技股份有限公司研發。取實時定量熒光PCR熔解曲線法初篩為陽性并處理好的標本1 ml加入有螺旋蓋的前處理管中，加入相當于標本2倍體積的處理液，旋緊管口振蕩15～30 s，室溫靜置15 min 打開反應盒，取2 ml處理好的標本由加樣孔緩慢加入反應盒，然后將反應盒放在檢測模塊，檢測異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、氟喹諾酮類藥品的耐藥基因。按設定好的程序進行擴增和熔解曲線分析；反應結束后在窗口下直接觀察結果[8]。

由于前期研究及經費原因，當同一例患者的膿液和組織標本相同技術檢測MTB同時為陽性時，則僅送檢其中一種標本行PCR熔解曲線法耐藥基因或MGIT 960表型藥敏試驗，即同一標本不同時采用兩種技術進行耐藥性檢測。

三、統計學處理

采用SPSS 23.0軟件進行數據的統計學分析，組間率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、 兩種技術對不同術中標本檢測MTB的檢出結果

300份術中標本(膿液和組織)，PCR熔解曲線法核酸檢測MTB的總體陽性率(44.0%，132/300)明顯高于MGIT 960培養(18.0%，54/300)(χ2=47.405，P=0.000)。

PCR熔解曲線法核酸檢測Ct值<30(即陽性)的組織標本占比(50.0%)明顯高于膿液標本的占比(38.0%)，而MGIT 960培養檢測組織標本的陽性占比(12.7%)明顯低于膿液標本(23.3%)，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，見表1。

二、兩種技術病原學診斷陽性結果的比較

進一步分析結果顯示，MGIT 960培養、PCR熔解曲線法、兩種方法聯合檢測150例患者的病原學診斷陽性占比(只要其中1種方法檢測為陽性即判定該例患者為病原學陽性)分別為30.7%、66.7%、70.7%。MGIT 960培養與PCR熔解曲線法檢測陽性結果比較，以及MGIT 960培養與聯合檢測陽性結果比較，差異均有統計學意義；而PCR熔解曲線法與聯合檢測陽性結果比較，差異無統計學意義，見表2。

表1 不同手術標本(組織、膿液)應用兩種技術檢測MTB陽性結果的比較

表2 150例患者采用兩種技術單獨及聯合檢測結果的比較分析

表3 兩種檢測技術對5種藥品的耐藥性檢出情況比較

三、兩種技術對術中標本MTB的耐藥檢出情況

132份PCR熔解曲線法核酸檢測和54份MGIT 960培養陽性標本中，100例有PCR熔解曲線法耐藥基因檢測結果，46例有MGIT 960表型藥敏試驗檢測結果，僅40例患者同時有兩種技術的耐藥檢測結果。以40例為研究對象，MGIT 960表型藥敏試驗和PCR熔解曲線法耐藥基因檢測對異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星的耐藥檢出率分別為20.0%和17.5%、17.5%和15.0%、17.5%和17.5%、17.5%和22.5%、5.0%和7.5%，差異均無統計學意義(P值均>0.05)，見表3。

討 論

結核病一直是全球性傳染病中重要的衛生問題[9]，且耐藥結核病例數近年來呈不斷上升趨勢。《2019全球結核病報告》[10]估算全球利福平耐藥結核病患者約為48.4萬例，其中耐多藥結核病患者約占78%；在全球30個結核病高負擔國家中，利福平耐藥結核病患者最多的3個國家依次為印度(13.0萬例,占全球的27%)、中國(6.6萬例，占14%)和俄羅斯(4.1萬例，占9%)，中國仍然是全球耐藥結核病高負擔國家之一。耐多藥結核病的早期診斷和治療是目前結核病控制的熱點和難點之一，明顯降低了結核病的治愈率。

目前，胸外科常見于胸膜的第五類型結核病為結核性膿胸[11]，臨床上一般通過抗酸染色或培養檢測患者胸腔膿液或胸膜活檢組織樣本中是否存在抗酸桿菌為診斷“金標準”，或在排除其他肉芽腫性疾病的情況下，能夠在胸膜組織標本中發現干酪樣壞死肉芽腫組織[12]。此類疾病往往在全身抗結核藥品治療后進一步行手術治療，雖常規對患者行耐藥性篩查，但難以克服以下問題：其一，術前獲取標本為有創方式，可能存在感染或穿刺傷口長期不愈的風險；其二，術前穿刺采集標本較困難，無法針對性取材，且送檢多為膿液標本，培養結果陰性較多，若反復送檢會增加患者的經濟負擔；其三，MTB生長緩慢，至少2～4周以上才能確定其藥敏試驗結果[13]，此時部分患者往往已行手術治療，如果患者為耐多藥結核病，術后將有可能造成結核病復發或播散。因此，提高標本送檢陽性率、快速進行耐藥性檢測篩查、指導臨床醫師判斷抗結核藥品的耐藥程度尤為重要[14]。

隨著近年來結核病分子診斷技術的新興與發展，早期快速診斷耐藥突變技術不斷涌現，這些基于分子層面的分析可有效用于快速鑒定抗生素耐藥性相關的基因突變和單核苷酸多態性。分子測序具有高可靠性，但因價格昂貴而難以廣泛用于微生物實驗室[15]；另外，基因診斷法明顯縮短了藥敏試驗周期，但在我國只能用于MTB對異煙肼和利福平耐藥突變基因的檢測。2016年9月廈門致善生物科技股份有限公司繼2013年推出的異煙肼和利福平耐藥突變檢測試劑后又推出乙胺丁醇、鏈霉素、氟喹諾酮類藥品耐藥突變PCR熔解曲線法檢測試劑，可同時檢測MTB對五種抗結核藥品的耐藥突變，是目前檢測藥品品種較全面的MTB藥敏試驗分子檢測試劑。PCR熔解曲線法是一種簡單快速的PCR檢測技術，其主要檢測原理為耐藥基因的基因突變會導致DNA雙鏈的結合力下降，從而導致相應的熔解溫度(Tm)值下降，即野生型基因有特定的Tm值，而突變型基因因為結合能力下降導致Tm值發生變化，據此可以區分和檢測出突變型和野生型。PCR 熔解曲線法檢測具有一定的全面性，在技術層面PCR熔解曲線法采用閉管法，即將檢測樣本和檢測試劑集中于反應管中，在反應過程中無須打開，避免了擴增產物的污染，有利于反應后熔解曲線的分析，且檢測可在3 h內完成[16]。

由于手術患者術前已行較長時間的抗結核藥品治療，使得大量敏感活菌死亡，而耐藥菌被篩選出來，因此有必要對結核性膿胸術后的耐藥性進行篩查。本研究采集了結核性膿胸術中病灶組織及膿液標本，分別送檢MGIT 960和PCR熔解曲線法檢測病原學和耐藥性，結果表明PCR熔解曲線法檢測MTB的陽性率明顯高于MGIT 960，故建議手術標本應優先PCR熔解曲線法行MTB核酸篩檢；而不同手術標本送檢的陽性率也存在差異，其中送檢PCR熔解曲線法的陽性標本中，組織標本(占比50.0%)明顯高于膿液標本(占比38.0%)，而送檢MGIT 960的組織標本(12.7%)明顯低于膿液標本(23.3%)，與沈煉[17]對膿液培養陽性率(21.95%)的研究結果相近。可能因為術前經過抗結核藥品治療后，大部分敏感活菌死亡造成MTB DNA釋放，組織標本通過纖維板包裹后核酸含量較高，而膿液中由于抗結核藥品通過組織擴散較為困難，導致殘留活菌量較多。故建議行PCR熔解曲線法檢測時優選組織標本送檢，行MGIT 960檢測時優選膿液標本，可在一定程度上指導臨床醫師送檢，增加送檢陽性率，減少重復送檢，減輕患者經濟負擔。進一步對150例患者病原學診斷陽性率的分析發現，單獨送檢MGIT 960并不能達到國家要求50%以上的標準，而PCR熔解曲線法、兩種方法聯合檢測均超過了65%，均明顯高于MGIT 960，但后兩者檢測差異無統計學意義。提示聯合檢測并不優于單獨的PCR熔解曲線法，認為PCR熔解曲線法的陽性檢出率已較高，基本包含了MGIT 960檢出的陽性患者，聯合檢測并沒有提高患者的陽性檢出率。故認為現階段雖然MGIT 960在病原學檢測中必不可少，但并不能滿足臨床需求，而PCR熔解曲線法在快速獲得結果的同時，不僅能滿足國家對病原學陽性檢出率的要求，還可以進一步檢測患者的耐藥性，對術后抗結核治療進行指導。

本研究PCR熔解曲線法耐藥基因檢測與MGIT 960藥敏試驗對異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星的耐藥檢出率分別為20.0%和17.5%、17.5%和15.0%、17.5%和17.5%、17.5%和22.5%、5.0%和7.5%，差異均無統計學意義。與Pang等[18]、吳慧娜等[19]和宋華峰等[20]的報道接近，說明PCR熔解曲線法耐藥基因檢測對異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星的耐藥檢出率與MGIT 960藥敏試驗結果一致，且檢測時間短，認為結核性膿胸患者可根據PCR熔解曲線法的耐藥基因檢測結果制定術后抗結核藥品方案，為耐藥結核病的治療贏得時間[21]。但是，PCR熔解曲線法基因也存在一定的局限性，該方法篩選中不包含氨基酸序列，可能會將不引起氨基酸改變的沉默突變歸為突變一類，造成假陰性結果[22]；同時，由于分子生物學檢測的耐藥基因位點尚不完善，檢測藥品種類少，暫時無法檢測除左氧氟沙星以外的其他二線抗結核藥品的耐藥性[23]，對后期耐藥結核病的治療指導有限，但隨著分子生物學檢測的快速發展，相信這一技術會成為臨床上重要的檢測方法。

綜上所述，結核性膿胸患者術中病灶送檢PCR熔解曲線法核酸檢測MTB的總體陽性率明顯高于MGIT 960培養，且組織標本送檢該方法檢測的陽性率高于膿液標本，耐藥檢出率與MGIT 960表型藥敏試驗相近，可快速檢測MTB陽性及耐藥性，可為術中精準取材及術后用藥提供一定的指導。