高效液相色譜法測(cè)定枸杞中的黃曲霉毒素

李單單，賀金濤

（河南進(jìn)口肉類指定口岸漯河查驗(yàn)區(qū)服務(wù)中心，河南漯河 462000）

黃曲霉毒素（AFT） 是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素是主要由黃曲霉（Aspergillus flavus） 寄生曲霉（A.Parasiticus） 產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的幾率最高。其具有高毒性和致癌性，1993 年被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I 類致癌物[1-3]。黃曲霉毒素常以AFTB1，AFTB2，AFTG1，AFTG24 種形式存在，其中AFTB1的毒性最強(qiáng)[4]。黃曲霉毒素在農(nóng)產(chǎn)品中幾乎無(wú)法避免，2017 年最新頒布的國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)《食品中真菌毒素限量》規(guī)定了玉米、玉米面（渣、片）、玉米制品、花生及其制品、花生油、玉米油中AFTB1的最高限量為20 μg/kg，稻谷、糙米、大米、植物油脂（花生油、玉米油除外） 中AFTB1的最高限量為10 μg/kg，小麥、大麥、其他谷物、小麥粉、麥片、其他去殼谷物、發(fā)酵豆制品、其他熟制堅(jiān)果及籽類、醬油、醋、釀造醬中AFTB1的最高限量為5.0 μg/kg。人們經(jīng)常使用高效液相色譜法檢測(cè)試樣中的黃曲霉毒素，能同時(shí)對(duì)樣品中的黃曲霉毒素種類進(jìn)行定性、定量分析，具有快速、高效、靈敏、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在黃曲霉毒素檢測(cè)方面發(fā)揮著重要的作用，已經(jīng)成為檢測(cè)黃曲霉毒素的主要方法[5-7]。

枸杞兼具多種醫(yī)療保健功效，是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用食物，能夠增強(qiáng)非特異性免疫功能、提高抗病能力，還具有抗衰老、抗疲勞、抗輻射損傷、調(diào)節(jié)血脂、降血糖、降血壓、養(yǎng)肝、滋腎、潤(rùn)肺等多種保健功效。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

安捷倫1200 型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；配熒光檢測(cè)器G1321A，Cloversil Myco-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；Aura光化學(xué)衍生器PHRED，美國(guó)Aura 產(chǎn)品；黃曲霉毒素總量免疫親和柱，北京勤邦生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；科樂(lè)福12 位泵流操作架；ML204T 型電子分析天平，梅特勒- 托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品；多位渦旋振蕩器、超聲波清洗器，中國(guó)昆山舒美產(chǎn)品；0.22 μm有機(jī)濾膜，天津津騰公司產(chǎn)品。

黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[Pribolab]；甲醇（色譜純），美國(guó)Fisher 提供；試驗(yàn)用水為Milli-Q Advantage A10 超純水，美國(guó)Millipore 公司提供；氯化鈉（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；玻璃纖維濾膜90 mm。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將黃曲霉毒素混標(biāo)用體積分?jǐn)?shù)45%的甲醇溶液稀釋成7 個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，以此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，AFTB1的系列質(zhì)量濃度分別為1，4，8， 10，20，40，50 ng/mL；AFTB2的系列質(zhì)量濃度為0.26，1.04， 2.08，2.60，5.20，10.40，13.00 ng/mL；AFTG1的系列質(zhì)量濃度為1.2，4.8，9.6，12.0，24.0， 48.0，60.0 ng/mL；AFTG2的系列質(zhì)量濃度為0.25， 1.00，2.00，2.50，5.00，10.00，12.50 ng/mL。用液相色譜儀對(duì)該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.2 液相色譜條件

液相色譜柱：Cloversil Myco-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；色譜柱柱溫40 ℃；流動(dòng)相：甲醇∶水= 45∶55，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量80 μL；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。

1.2.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱樣（4.000 g） →加入氯化鈉（1.0 g） →準(zhǔn)確加入20 mL 甲醇- 水（70∶30） →振蕩混勻（20 min）→超聲提取（20 min） →離心（8 000 r/min，5 min） →取上清液（10 mL） →加入超純水（30 mL） →渦旋混勻→過(guò)玻璃纖維濾紙→準(zhǔn)確取20 mL 液體→過(guò)免疫親和柱→親和柱中加入10 mL×2 超純水（最后把水抽干） →甲醇洗脫（1.0 mL） →水沖洗（1.0 mL），甲醇和水收集到一起→過(guò)有機(jī)濾膜→高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

在1.2.2 條件下對(duì)1.2.1 系列標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表1，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2線性范圍見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2 線性范圍

2.2 精密度試驗(yàn)

在1.2.1 中選擇質(zhì)量濃度為10.0，2.6，12.0，2.5 ng/mL 的黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2峰面積的RSD 分別為0.79%，1.38%，0.49%，0.54%，表明儀器精確度較好。

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2（10.0，2.6，12.0，2.5 ng/mL） 的精密度（n=6） 見表2。

2.3 回收率試驗(yàn)

取陰性樣品，AFTB1的3 個(gè)添加水平分別為2.5，10.0，30.0 μg/kg；AFTB2的3 個(gè)添加水平分別為0.65，2.60，7.80 μg/kg；AFTG1的3 個(gè)添加水平分別為3，12，36 μg/kg；AFTG2的3 個(gè)添加水平分別為0.625，2.500，7.500 μg/kg，加入對(duì)應(yīng)體積的標(biāo)準(zhǔn)品靜置過(guò)夜，按照1.2.3 樣品前處理方法處理樣品，上機(jī)測(cè)定。

表2 黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2（10.0，2.6，12.0，2.5 ng/mL） 的精密度（n=6）

樣品中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2回收率（n=3）見表3，高效液相色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2.4 檢出限和定量限

根據(jù)信噪比S/N=3 和S/N=10 確定目標(biāo)物的檢出限和定量限，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的檢出限分別為0.03，0.01，0.03，0.01 μg/kg；黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的定量限分別為0.10，0.03，0.10，0.03 μg/kg。

3 結(jié)論

黃曲霉毒素是對(duì)人類健康危害較大的真菌毒素，黃曲霉毒素污染問(wèn)題長(zhǎng)期受到社會(huì)關(guān)注[8]。黃曲霉毒素可能在食品原料中也可能在食品加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等任一環(huán)節(jié)中產(chǎn)生。因此，對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)能夠有效保障人們的餐桌安全。

利用免疫親和柱- 高效液相色譜柱后光化學(xué)衍生法檢測(cè)枸杞中的黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2，4 種毒素的出峰時(shí)間早，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，分離度滿足試驗(yàn)需求，用柱后衍生的方法操作簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng)。枸杞既是食材又是中藥，是一種營(yíng)養(yǎng)成分比較高的植物資源，因此加強(qiáng)對(duì)枸杞中黃曲霉毒素的檢測(cè)，可為人們放心食用提供數(shù)據(jù)支持。