代謝組學(xué)在結(jié)直腸癌中西醫(yī)診療應(yīng)用的研究進(jìn)展

尚芳，裴斌，周偉康，樊志敏

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2.南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210000)

0 引言

近年來(lái)，隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)在我國(guó)的發(fā)病率逐年上升[1]。手術(shù)治療是目前治療CRC的首選方法，但面臨創(chuàng)傷大、風(fēng)險(xiǎn)高等問(wèn)題，對(duì)患者而言恢復(fù)周期長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)壓力大。同時(shí)，與早期患者相比中晚期患者預(yù)后較差。因此，結(jié)直腸癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療尤為重要。惡性腫瘤是由多種因素共同作用造成機(jī)體功能紊亂的復(fù)雜疾病，其組織與人體正常組織在代謝方面有著顯著差異。代謝組學(xué) (metabonomics/metabolomics) 通過(guò)生物體內(nèi)代謝物進(jìn)行系統(tǒng)定量分析的方法，尋找出代謝物與生理、病理之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。其研究方法非常類似于我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)司外揣內(nèi)、見(jiàn)微知著的診療思想。辨證論治是中醫(yī)的核心內(nèi)容，更是臨床診療的基礎(chǔ)。代謝組學(xué)從微觀視角通過(guò)生物體代謝物能夠?qū)ι矬w所患疾病得出診斷，從而可以為預(yù)后治療情況、臨床治療情況提供更多有效評(píng)價(jià)依據(jù)。中醫(yī)辯證論治則是從宏觀視角，指導(dǎo)臨床思維，二者相輔相成?，F(xiàn)將近年來(lái)代謝組學(xué)在CRC中西醫(yī)診療中的應(yīng)用綜述如下。

1 代謝組學(xué)簡(jiǎn)介

1.1 代謝組學(xué)的背景和定義

1998年Tweeddale等在研究大腸桿菌的代謝時(shí)首次提出代謝組(Metabolome)這一概念，并提出“代謝物組成分析能夠提供有關(guān)細(xì)胞代謝和調(diào)控的重要信息”。1999年，Nicholson[2]等在近二十年生物代謝系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上提出了代謝組學(xué)的定義，其解釋為“對(duì)生物體病因或基因改變等情況下代謝參數(shù)的定量研究”。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)代謝組學(xué)的解釋可概括為：所謂的代謝組學(xué)可以簡(jiǎn)單理解為：生命個(gè)體對(duì)機(jī)體內(nèi)外環(huán)境作出的代謝應(yīng)答，通多定量方法對(duì)應(yīng)答全貌、動(dòng)態(tài)進(jìn)行測(cè)定的學(xué)科[3]。

1.2 代謝組學(xué)的研究方法及特點(diǎn)

代謝組學(xué)的研究對(duì)象是相對(duì)分子質(zhì)量小于1000的小分子代謝物質(zhì)，包括糖、氨基酸、脂質(zhì)等。代謝組學(xué)融合了包括化學(xué)計(jì)量學(xué)、生物信息學(xué)在內(nèi)的多種研究方法[4]。相較于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，代謝組學(xué)具有以下特點(diǎn)：(1)檢測(cè)樣本容易獲取，且采集樣本過(guò)程中對(duì)人體傷害較小；(2)檢測(cè)指標(biāo)遠(yuǎn)比基因和蛋白質(zhì)少很多，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易行；(3)代謝組學(xué)可以為藥理研究、病理生理提供動(dòng)態(tài)信息；(4)代謝組學(xué)將生物體看作動(dòng)態(tài)的整體，研究?jī)?nèi)外因素變化時(shí)對(duì)這一整體的代謝影響，進(jìn)而揭示生化途徑[4,5]。

目前代謝組學(xué)已成為疾病研究的新工具，為疾病的認(rèn)識(shí)提供了新視角，廣泛用于各個(gè)系統(tǒng)疾病相關(guān)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)[6,7]，且在對(duì)心臟病[8,9]、糖尿病[10,11]、腫瘤[12,13]、阿爾茲海默癥[14,15]的研究中取得了進(jìn)展。不僅推動(dòng)了疾病識(shí)別與治療進(jìn)程，同時(shí)也可以為新藥測(cè)試、精準(zhǔn)治療提供更多參考和依據(jù)[16]。

代謝組學(xué)研究過(guò)程基本上分為如下幾個(gè)步驟：

第一，制備相關(guān)樣品。需要將研究對(duì)象導(dǎo)入到刺激環(huán)境中，比如：改變其基因組，剔除某些基因鏈或?qū)胄禄?，這樣可以觀察轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平的參數(shù)變化，也可以從環(huán)境因素入手，觀察基因轉(zhuǎn)錄的情況。

第二，采集樣本并進(jìn)行預(yù)處理，樣本采集內(nèi)容有很多，如：研究對(duì)象的血液、尿液、組織細(xì)胞等，甚至也可以將整個(gè)生物體視為樣本。在實(shí)驗(yàn)活動(dòng)中需要兼顧到收集樣本時(shí)間，樣本種類、群體分布等因素，這些都會(huì)影響到后續(xù)分析。

第三，分析代謝物。一般是通過(guò)定量分析手段對(duì)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定量分析方法主要有核磁共振、質(zhì)譜、色譜等等，依托更多信息技術(shù)平臺(tái)可以分析出樣本類型、含量及變化情況，從而構(gòu)建代謝組數(shù)據(jù)。當(dāng)前最常用的分析技術(shù)主要是核磁共振、質(zhì)譜技術(shù)。這些分析方法基本上可以劃分為3大類。比如：色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀分析方法又細(xì)分為包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀(LC/MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀(GC/MS)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜(CE/MS)等，其中：對(duì)于分離高揮發(fā)性混合物可以采取 GC-MS 方法，對(duì)于分離低揮發(fā)性混合物可以采取LC-MS方法[17]。不同方法其優(yōu)勢(shì)及劣勢(shì)均不同，為此在代謝組研究分析中常常會(huì)將二三種方法聯(lián)合使用。

第四，分析數(shù)據(jù)，完成了代謝組數(shù)據(jù)分析之后，需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)量分析，方法有很多，一類是非監(jiān)督分析，如：主成分分析(PCA) 、非線形映射(NLM) 、聚類分析(HCA) 等；一類是監(jiān)督分析，如：偏最小二乘法(PLS) 、獨(dú)立建模分類法(SIMCA) 、人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)(ANN) 等[18]。最常用的方法是主成分分析法和偏最小二乘法。主成分分析法主要用于對(duì)比代謝組之間的區(qū)別和相似程度，而偏最小二乘法給出導(dǎo)致區(qū)別或相似的貢獻(xiàn)變量及其貢獻(xiàn)程度。

2 代謝組學(xué)在CRC診療中的應(yīng)用

2.1 診斷

機(jī)體的正常生理活動(dòng)需要各個(gè)系統(tǒng)平衡協(xié)作，如果系統(tǒng)平衡被內(nèi)部因素或外部因素影響，生理機(jī)體代謝就會(huì)發(fā)生改變，生物體所有的活動(dòng)都是通過(guò)各個(gè)系統(tǒng)均衡運(yùn)行實(shí)現(xiàn)的，如果某一系統(tǒng)出現(xiàn)了混亂且沒(méi)有及時(shí)糾正，那么就會(huì)引發(fā)新問(wèn)題，積累到一定程度后就會(huì)出現(xiàn)宏觀性改變，甚至出現(xiàn)病理改變。對(duì)于代謝紊亂的問(wèn)題可以通過(guò)尿液或血液檢測(cè)得出，通過(guò)分析代謝情況能夠觀測(cè)出生物體變化情況，從而及早找出誘發(fā)疾病的代謝組標(biāo)志物簇。并了解發(fā)病相關(guān)的分子機(jī)制，就有可能在疾病的早期做到早期診斷和干預(yù)。目前臨床上CRC的診斷主要依賴內(nèi)鏡下診斷和病理診斷相結(jié)合。但結(jié)腸鏡檢查具有侵入性，患者耐受性差，穿孔風(fēng)險(xiǎn)大，且對(duì)操作者技術(shù)要求較高。代謝組學(xué)則很好地彌補(bǔ)了這一缺陷。

許多研究[19-21]表明代謝組學(xué)在癌癥的早期診斷方面具有巨大潛力?？死瓱峥死瓱崂瓱醄22]等收集結(jié)直腸癌確診患者血清標(biāo)本 40 例，癌前病變(包括潰瘍性腸病、結(jié)直腸腺瘤) 患者血清標(biāo)本 20 例，健康對(duì)照組血清標(biāo)本 60 例，通過(guò)使用核磁共振技術(shù)，依托了最小二乘分析方法，對(duì)采樣的三組血清進(jìn)行了檢測(cè)分析，觀察了代謝物情況，最終得出結(jié)論：在結(jié)直腸腫瘤對(duì)象體內(nèi)多種氨基酸含量出現(xiàn)了大幅度降低，但是血清內(nèi)部的酮體含量卻超出了正常范圍。綜合對(duì)比腫瘤患者與結(jié)直腸癌前病變患者的各項(xiàng)血清指標(biāo)來(lái)看，腫瘤患者和結(jié)直腸癌前病變患者與正常人相比部分代謝物含量下降明顯，如：血清膽堿、亮氨酸、β －葡萄糖代謝物等。結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推測(cè)出，結(jié)直腸癌前病變患者極有可能會(huì)癌變。馬延磊[23]使用了GC—MS技術(shù)，引入了健康對(duì)象與患結(jié)直腸癌對(duì)象，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)二組對(duì)象的代謝譜與總代謝水平有顯著不同，同時(shí)還參考了美聞標(biāo)準(zhǔn)以及技術(shù)研究院質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)研究對(duì)象的代謝物進(jìn)行了檢測(cè)分析，應(yīng)用數(shù)學(xué)模型PLS-DA進(jìn)行模式特征性分類。同時(shí)對(duì)腸癌組與對(duì)照組的區(qū)分率利用監(jiān)督性的聚類分析進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組代謝物相對(duì)含量相比，腸癌一組中血清L－纈氨酸、L－蘇氨酸等含量顯著較低，但是3-羥丁酸這一指標(biāo)卻增加，后來(lái)通過(guò)監(jiān)督性分析方法進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)得出結(jié)論，為結(jié)直腸癌診斷提供了依據(jù)，將其診斷準(zhǔn)確率大大提升至93.5%。Cheng等[24]使用氣相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜和超高效液相色譜四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，對(duì)101例CRC患者和103例健康受試者進(jìn)行尿液代謝組學(xué)研究。研究發(fā)現(xiàn)在CRC受試者中觀察到許多代謝途徑失調(diào)，例如糖酵解，TCA循環(huán)，尿素循環(huán)，嘧啶代謝，色氨酸代謝，多胺代謝以及腸道微生物-宿主共代謝。并構(gòu)建了含有七大代謝物的診斷模型。

2.2 評(píng)估療效，指導(dǎo)個(gè)體化治療

代謝組學(xué)在腫瘤的臨床療效檢測(cè)和個(gè)體化治療中也應(yīng)用十分廣泛。接受手術(shù)或放化療的患者，體內(nèi)腫瘤負(fù)荷顯著降低，機(jī)體代謝也會(huì)相應(yīng)發(fā)生改變。利用代謝組學(xué)技術(shù)分析患者代謝譜的變化有助于評(píng)估手術(shù)或放化療的效果。Qiu 等[25]人綜合對(duì)比了術(shù)前術(shù)后患者的代謝情況，并綜合運(yùn)用了正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)分析方法，得出二組數(shù)據(jù)存在顯著差異，經(jīng)過(guò)手術(shù)治療后，實(shí)驗(yàn)組對(duì)象的氨基酸代謝水平提高，相對(duì)應(yīng)的三羧酸循環(huán)和微生物代謝水平降低。患者與正常健康人員代謝組數(shù)據(jù)對(duì)比顯示，經(jīng)過(guò)手術(shù)干預(yù)治療后，患者各項(xiàng)代謝水平正逐步恢復(fù)。Ma[26]綜合使用了 GCMS 與模式識(shí)別技術(shù)，引入了30名研究對(duì)象，分析了手術(shù)干預(yù)前后的代謝水平變化，結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)手術(shù)治療后，患者七大類代謝水平降低，如：L-纈氨酸、1-脫氧葡萄糖等等，但是L-酪氨酸代謝水平卻增強(qiáng)了這為精準(zhǔn)診斷和治療提供了依據(jù)。

抗腫瘤藥物基本治療原理是抑制腫瘤生長(zhǎng)，但是很難將腫瘤縮小。通過(guò)影像檢查可以看出腫瘤變化情況，但是影像卻不能全面揭示抗腫瘤藥物的療效，為此需要借助其他分析手段和技術(shù)，了解藥物進(jìn)入人體后的變化及過(guò)程，從而判斷出藥物的療效[27]，以減少對(duì)病患的副作用，為臨床用藥提供指導(dǎo)，從而設(shè)計(jì)個(gè)性化的治療方案。比如：國(guó)外學(xué)者Backshall[28]研究中引入了54名結(jié)直腸癌患者，這些患者都沒(méi)有經(jīng)過(guò)手術(shù)治療，觀察了患者化療前后的代謝水平，得出了一系列實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)分析得出：化療前患者的低密度脂蛋白衍生脂質(zhì)越高，越容易產(chǎn)生化療后的不良反應(yīng)。

2.3 監(jiān)測(cè)耐藥情況

代謝組學(xué)在腫瘤的耐藥性方面的研究是目前臨床研究的一個(gè)熱點(diǎn)課題。腫瘤耐藥是目前臨床上面臨的一個(gè)棘手問(wèn)題，也是導(dǎo)致患者化療失敗的重要原因。還有研究得出，一旦腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了耐藥性，那么這些細(xì)胞就會(huì)在蛋白、半胱氨酸等通路上增加代謝能力，因此通過(guò)代謝組檢測(cè)數(shù)據(jù)可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞是否具有耐藥性，從而為臨床用藥提供指導(dǎo)[29]。

3 代謝組學(xué)在CRC的中醫(yī)辨證論治中的應(yīng)用

結(jié)直腸腫瘤屬中醫(yī)“臟毒”、“鎖肛痔”范疇。結(jié)腸是大腸的一部分，在中醫(yī)理論中與脾腎密切相關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為結(jié)直腸腫瘤的病理因素主要是濕、毒、瘀、虛。憂思抑郁，脾胃不和，濕熱蘊(yùn)結(jié)，日久化毒，乘虛下注，浸淫腸道，氣滯血瘀，濕毒瘀滯凝結(jié)而成腫瘤；或飲食不節(jié)，久痢久瀉，息肉蟲積，損傷脾胃，運(yùn)化失司，濕熱內(nèi)生，熱毒蘊(yùn)結(jié)，流注大腸，蘊(yùn)毒積聚，結(jié)而為腫。總之，濕熱下注、火毒內(nèi)蘊(yùn)，結(jié)而為腫是病之標(biāo)；正氣不足、脾腎兩虧乃病之本。

大腸癌辨證關(guān)鍵在于首辨寒熱虛實(shí)，次辨在氣在血。大腸癌的病情復(fù)雜，臨床表現(xiàn)形式多種多樣，目前尚無(wú)統(tǒng)一的辨證分型。各位醫(yī)家[30,31]在傳承名家經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合自身臨床體會(huì)，在對(duì)大腸癌的認(rèn)識(shí)上具有一些相同點(diǎn)，如均認(rèn)為病機(jī)為正虛邪實(shí)，虛實(shí)夾雜。中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)發(fā)布的《中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)-腫瘤中醫(yī)診療指南》[32](08版)將大腸癌分為如下六種證型：脾虛氣滯證、濕熱蘊(yùn)結(jié)證、瘀毒內(nèi)阻證、脾腎陽(yáng)虛證、肝腎陰虛證、氣血兩虛證。這是目前較有影響力的分類規(guī)范。

傳統(tǒng)中醫(yī)望聞問(wèn)切的診病方法因其主觀性和缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)而被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所質(zhì)疑，辨證結(jié)果更是與醫(yī)生的自身水平密切相關(guān)[33]。代謝組學(xué)方法可動(dòng)態(tài)研究復(fù)雜條件下機(jī)體病理生理狀態(tài)變化，揭示代謝相關(guān)疾病本質(zhì)。這與中醫(yī)“證”的概念十分契合?！白C”是疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中某一階段的病理概括。“證”不是一成不變的。代謝組學(xué)顯示，隨著時(shí)間的變化，代謝物的種類、濃度、比例也有變化。由此觀之，代謝組學(xué)與中醫(yī)癥候存在很多相似之處，二者可以相互結(jié)合使用，將代謝組學(xué)用于中醫(yī)癥候研究中，有助于揭示中醫(yī)證候的本質(zhì)，為中醫(yī)的現(xiàn)代化研究提供了新思路。

魏濱[34]等在對(duì)大腸癌和肝癌術(shù)后患者的血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)濕熱證影響人體的糖代謝，并且以影響糖類物質(zhì)分解和供能過(guò)程為主要特征(糖酵解和TCA是實(shí)現(xiàn)人體能量供給的重要通路)，包括氨基酸和嘌呤的轉(zhuǎn)化和降解也受到濕熱證的影響。馬乃霞[35]通過(guò)HPLC-MS技術(shù)對(duì)晚期腸癌偏實(shí)證與偏虛證患者血清樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析，利用PCA、OPLS-DA分析法，得出結(jié)論：與偏虛證患者對(duì)比，偏實(shí)證患者血清中異亮氨酸、天冬氨酸、?；撬岽x水平較高，但是丙酮、乙酰乙酸以及阿洛酮糖代謝量較低。蔣鑫超[36]使用了超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)正常組與實(shí)驗(yàn)組對(duì)象的代謝情況展開(kāi)了分析，實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)正常人組和脾虛濕郁證大腸癌組患者的血漿和尿液進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)合偏最小二乘法-顯著性分析聯(lián)合法尋找脾虛濕郁證大腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的生物標(biāo)志物群。經(jīng)過(guò)研究得出大腸癌脾虛濕郁證的標(biāo)志物簇，分別是：血清中的甘氨酸、L-絲氨酸、膽堿、精氨酸、檸檬酸五大類，尿液中的丙氨酸、檸檬酸、苯乙?；劝滨０啡箢悾瑫r(shí)實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)了代謝物三羧酸循環(huán)情況，代謝物色氨酸的通路變化情況，從而為大腸癌疾病診斷或是脾虛濕郁證的證型鑒別提供了客觀化和量化的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。

4 討論

代謝組學(xué)技術(shù)通過(guò)對(duì)代謝產(chǎn)物的分析，明確生物體的代謝水平，有利于探索生命調(diào)節(jié)中完整的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)進(jìn)一步了解疾病本質(zhì)、藥物的顯效機(jī)制及潛在的生物標(biāo)志物提供了新的思路[37]。但是目前代謝組學(xué)尚有許多不足之處[38-40]，如：①關(guān)于代謝組學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)較繁冗龐大，數(shù)據(jù)分析消耗時(shí)間成本較大，發(fā)展至今依然沒(méi)有建設(shè)數(shù)據(jù)庫(kù)，很難精準(zhǔn)快速地找到對(duì)比標(biāo)記物數(shù)據(jù)；②目前代謝組學(xué)研究樣本量小，證候診斷無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性差，缺少驗(yàn)證性研究；③生物體代謝易受環(huán)境、心理等多種復(fù)雜因素影響，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都會(huì)產(chǎn)生一定的影響，結(jié)果會(huì)存在誤差，加上各種分析技術(shù)的限制，至今還沒(méi)有一項(xiàng)分析精準(zhǔn)全面的方法，需要綜合多種方法進(jìn)行分析，且很多研究都是運(yùn)用了動(dòng)物做實(shí)驗(yàn)對(duì)象，構(gòu)建的動(dòng)物模型難以得到行業(yè)公認(rèn)，且人與動(dòng)物之間具有本質(zhì)區(qū)別，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)臨床缺乏說(shuō)服力；④對(duì)于同個(gè)體的不同樣本檢測(cè)結(jié)果會(huì)存在差異，如：血液檢測(cè)和尿液檢測(cè)結(jié)果差異較大，結(jié)論就會(huì)產(chǎn)生分歧，給制定合理精準(zhǔn)的治療方案帶來(lái)困難。將中醫(yī)證型引入大腸癌模型中，研究其對(duì)大腸癌治療和預(yù)后的影響并不多見(jiàn)。

現(xiàn)代醫(yī)療模式正逐漸從重視疾病向重視預(yù)防發(fā)展，《素問(wèn)》有云：“圣人不治已病治未病”，這正是中醫(yī)“未病先防”預(yù)防保健觀念的體現(xiàn)。大腸癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療對(duì)于預(yù)后十分重要。雖然代謝組學(xué)技術(shù)并不完全成熟，但不可否認(rèn)代謝組學(xué)技術(shù)在結(jié)直腸癌的預(yù)防和治療方面有著其它組學(xué)無(wú)法取代的優(yōu)勢(shì)。代謝組學(xué)已經(jīng)成為傳統(tǒng)中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)交流融合的橋梁。如果能夠?qū)⒋x組學(xué)與其他生物學(xué)科、技術(shù)融合，這對(duì)于中醫(yī)領(lǐng)域的證候整體、動(dòng)態(tài)、全面發(fā)展將會(huì)大有裨益，也將可以走出一條獨(dú)具中國(guó)特色的中醫(yī)治療路徑[41]。